桿狀病毒系統蛋白質表達實驗——重組蛋白的代謝標記

由于重組蛋白表達的時候，宿主蛋白質的合成基本終止，因此體內代謝標記是檢測重組蛋白的敏感方法。所有的標記氨基酸都摻入到晚期病毒特異的蛋白質（包括目的蛋白）的合成。³⁵S 標記的甲硫氨酸和半胱氨酸是常用的放射標記的氨基酸。為了獲得更好的結果，在標記之前細胞內的這兩種氨基酸應當被清除：將細胞在無甲硫氨酸和半胱氨酸的培養基中孵育 30 min 即可。摻入效率依賴于所感興趣的特定蛋白質的甲硫氨酸和半胱氨酸的數量。標記后裂解細胞，蛋白質用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并用放射自顯影顯示。

野生型桿狀病毒草地夜蛾（Sf9）細胞高滴度的重組桿狀病毒儲液

PBS1 × SDS 樣品緩沖液10% 胎牛血清

Graces昆蟲細胞培養基（不含甲硫氨酸／不含甲硫氨酸和半胱氨酸）EXPRE 35 S 35 STNM-FH昆蟲培養基60 mm 組織培養皿27℃ 培養箱（濕度可選）15 ml 聚丙烯離心管Beckman GPR 離心機沸水浴／100℃加熱板超聲儀

1. 接種 2.5 × 10⁶ 細胞于盛有 3 ml 含 10 % 胎牛血清的 TNM - FH 培養基的 60 mm 組織培養皿中。對每一假定重組病毒分別制備一個培養皿供感染用，并制備一個對照培養皿供野生型桿狀病毒感染。

2. 27℃ 溫育 1 h，使細胞貼壁。吸出培養液，然后加入 1 ml 重組病毒或 1 ml 含野生型病毒的培養液，感染復數（MOI）為 5～10。室溫溫育 1 h。

3. 將每個培養皿中的培養液移去后，再往其中加入 3 ml 含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培養液，27℃ 溫育 24～48 h。

4. 小心去除培養液，用不含甲硫氨酸或不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培養液洗細胞 1 次，加入 1 ml 不含甲硫氨酸或不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培養液，27℃ 溫育 30 min，然后每個培養皿中添加 EXPRE³⁵S³⁵S 至 0.25～0.5 μCi。27°C 溫育 3～4 h。

5. 將每個培養皿的細胞和培養物上清分別移至一支 15 ml 聚丙烯離心管，4°C 1000 g 離心 10 min。

6. 按照基本方案1，步驟 1.5～1.7 或 2.5～2.7，處理并分析細胞（非分泌型重組蛋白）或上清（分泌型重組蛋白）。如果有適用的抗體，建議將標記的裂解物先進行免疫沉淀，然后在 SDS 樣品緩沖液中煮沸，并在SDS-PAGE 中分離。

7. 用放射自顯影使蛋白質顯跡。從放射自顯影圖查看感染了重組病毒，而不是野生型桿狀病毒的細胞是否出現預期分子質量的蛋白質。

使培養皿傾斜，在一個角上移出和加入培養基以避免旋起單層細胞。