聚合酶免疫檢測方法
用酶免疫方法檢測食品中的李斯特氏菌，從20世紀80年代末到90年代初已有許多商品化產品供應于市場。
AOAC 公定方法996.14可應用于檢測在乳制品、紅肉、豬、禽類產品、水果、堅果、海產品、意大利面制品、蔬菜、奶酪、動物肉類、巧克力和蛋品中的單增李斯特氏菌及其他李斯特氏菌的檢測。
1、原理
Assurance ?多克隆酶聯免疫分析（EIA），將對單增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌抗原有高度特異性的抗體固定在微孔內壁上。經增菌培養后的樣品和陽性對照加到檢測板的微孔內。如有李斯特氏菌抗原存在則在微孔內形成抗體抗原混合物。沒有反應的樣品物質被沖洗掉。加入抗李斯特氏菌特異抗體，重復孵育、沖洗程序，然后加入堿性磷酸酶接合劑，使酶與李斯特氏菌抗原相結合，孵育后，沒有結合的接合物質被沖洗掉，加入底物顯色，用405～410nm的光學測量儀讀數，計算臨界值。可疑陽性結果須經培養方法證實。
2、培養基和試劑
①洗液、濃縮液 2％的吐溫-20水溶液。
②底物片劑 5mg ρ-磷酸硝基苯片劑。
③底物稀釋液 1mol/L二乙醇胺水溶液。
④陽性對照 穩定的無活性的李氏菌抗原。
⑤抗體溶液 能與李斯特氏菌抗原起反應的高純抗體。
⑥接合劑 堿性磷酸鹽抗體接合劑。
⑦終止液 20％的 EDTA 水溶液。
⑧包被有抗體的微量孔板 每孔都包被有李斯特氏菌的抗體的試條，96孔的托架和蓋子。
⑨加 LiCl 的改良 Fraser 肉湯(mFB+ LiCl) 55g 商品用 Fraser 肉湯基礎加1L 水攪拌至完全溶解（注意：不要加熱溶解）。當粉末完全溶解后，加4g LiCl 攪拌至完全溶解。121℃，15min 高壓滅菌。或者按以下方法制備45％ LiCl 溶液：將45g LiCl 加入100mL 容量瓶內，加純凈 H2O 溶解后，用純凈 H2O 稀釋到100mL；用0.2μm濾皿過濾滅菌LiCl 溶液，加2mL 滅菌的 LiCl 溶液到225mL 已滅菌的 mFB 內。不要加檸檬酸鐵胺（ferric am-monium citrate）到 mFB＋LiCl 肉湯內。
⑩緩沖的李斯特氏菌增菌肉湯（BLEB） 溶解36.1g商用Lis增菌肉湯，8.5g（3-［N-morpholino］propureesulfonic acid）（MOPS）和13.7g的 MOPS 鈉鹽。于1L純凈H2O中，加熱溶化混勻。121℃，15min 高壓滅菌。
①診斷試劑 EIA 陽性結果需要培養確證。（參見 FDA《細菌分析手冊》現行版或其他標準檢測方法的單增李氏斯特氏菌部分）。
①～⑧可從BioControl Systems Assurance ? Listeria酶免分析試劑盒。
3、儀器
①培養箱 30℃±1℃和35～37℃。
②水浴 100℃±2℃或用設在100℃的流動蒸汽高壓鍋代替。
③微量板清洗器 用于清洗微量孔試條。可用洗瓶代替。
④微量板讀數儀 備有405～410nm 濾光器的光學儀器，能夠讀微量板，可以選用有打印機的。
⑤微量加樣器 精確至100μL 和250μL。
⑥渦旋振蕩器。
⑦稱樣天平 稱取測試樣品。
4、通則
所有試劑必須貯存在2～8℃在使用前放置室溫，每測試一份樣品，包括2個陽性對照和1個空白測試孔。每一樣品和試劑均使用單獨的吸嘴以避免交叉污染。同一試劑盒內容物均作為一個整體單位使用，不要與其他標號或其他產品混用。每一試劑均使用其專用的試劑或玻璃器皿以避免交叉污染。不要用已過期的試劑，不要重復使用微量板。
5、樣品制備
增菌無菌稱量25.0g 樣品到225mL mFB＋LiCl 中混勻（如果分析的樣品量較大按1：9稀釋倍數適當增加 mFB＋LiCl體積），30℃培養28h，吸取1mL 培養后的 mFB＋LiCl 到90mL BLEB 管中，30℃培養24h。
培養完將培養物混勻，放置1min 讓顆粒沉淀，然后吸取1mL 到試管內，冷藏保存增菌肉湯以備陽性結果進一步鑒定。
將試管浸入沸水浴中15min 以滅活細菌。將試管冷卻到25～37℃后測試煮沸過的樣品在測試前可在2～8℃貯存4天。（注意：貯存過的試管樣品在加入微量孔內前要混勻）
6、酶標分析
①準備以下試劑，在測試前放置至室溫。
洗液1.0mL 的濃縮洗液，加100mL H2O（足夠洗48個孔），做好標記。洗液可在2～8℃貯存30天。
酶底物溶液加1片酶底物片劑到5.0mL 底物稀釋液中（足夠48個孔用），做好標記使用時需即配即用，未用完的棄去。
②設置405～410nm 濾光片于讀板儀中。
③取需要量的微量孔板條，放入架內，要有2個陽性對照和1個空白。將未用的微量孔板條放回有硅膠干燥劑的箔帶封好。清楚地標記好陽性對照、空白和樣品在架子上的位置。
④在滴入微孔前將測試樣品5和陽性對照用渦旋振蕩器逐一混勻。吸取100μL 測試樣到樣品孔內，吸取100μL陽性對照到每個陽性對照孔內，“空白”孔不要加任何物質。
⑤用提供的塑料蓋蓋上微孔板。35～37℃培育3min。在培育時不要在微孔板架上堆任何東西。
⑥用下面a或b的方法清洗每個孔3次（注意：足夠的清洗次數是獲得精確結果的條件）
a.由微量板清洗器完全去除孔內的內容物，立刻用洗液（大約250μL）充滿各個孔。重復上述步驟3次。不要將洗液溢出孔外，避免清洗不徹底或產生交叉污染。
b.倒轉微孔板，倒掉內容物，并將平板用力拍干，立即用清潔的洗瓶內的洗液將孔充滿，重復2次。
⑦在最后一次清洗后，立即將抗體溶液混勻（輕輕倒轉蓋子幾次），加100μL 抗體到每個孔內（包括對照和空白）。蓋上塑料蓋于35～37℃培養30min。
⑧按步驟⑥洗每個孔3次。
⑨在最后一次清洗后立即將接合劑混勻（輕輕倒轉瓶子幾次），加100μL接合劑至每孔內（包括對照和空白），蓋上蓋子于35～37℃培養30min。
⑩按步驟⑥清洗每個孔3次。
?在最后一次清洗后立即加100μL 底物溶液到每個孔內（包括對照和空白），蓋上蓋子于35～37℃培養30min。培養后立即進入讀數，如果未能及時讀數，加50μL 停止液到每個孔內并在1h 內讀數。
7、讀數
在405～410nm 處讀對照和樣品的吸收值A。在讀對照和樣品前用空白校準讀數儀。用空白孔的光密度值（OD）調節標定讀數器為零，開始測試樣品前先讀2個陽性對照孔。（注意：樣品的數值可能＜0，這并非不可能，它表示陰性結果）。
8、結果判斷
①對照值 陽性對照讀數值應＞0.8OD單位。在這個以下表示清洗過程有問題。如果讀數值小于0.8OD，重復測試步驟6中③，或與試劑公開聯系。如果讀數值超過讀數儀的上限，用2.5的讀數值計算臨界值。
②臨界值 計算兩個陽性質控的平均 OD 值，再乘以0.25得出臨界值。
③陰性結果 樣品的 OD 值小于臨界值為陽性。
9、陽性EIA樣品的鑒定
當樣品的數值≥臨界值時為陽性結果，必須用《細菌分析手冊》現行版描述的培養方法來確證。用冰箱保存的增菌肉湯分離菌株。