楊福全、付巖團隊在人血清N鏈接糖基化蛋白質組學獲進展

　　2月29日，國際蛋白質組學期刊Molecular & Cellular Proteomics 在線發表了由中國科學院生物物理研究所研究員楊福全團隊和中國科學院數學與系統科學研究院副研究員付巖團隊在人血清N-鏈接糖基化蛋白質組學研究中所取得的進展“Large-scale Identification of N-linked Intact Glycopeptides in Human Serum using HILIC Enrichment and Spectral Library Search”。

　　糖基化是最重要和最普遍的蛋白質翻譯后修飾之一。蛋白質糖基化在細胞中起著至關重要的作用，包括蛋白質折疊、轉運和穩定性的調控，以及細胞生長、細胞-細胞通訊、細胞-基質相互作用、病毒復制和免疫應答等各種生物學過程的調節。異常的蛋白質糖基化修飾通常與許多疾病的病理進展有關，包括癌癥、神經退行性疾病、肺部疾病、血液疾病和遺傳病等。大多數糖蛋白質是潛在的藥物作用靶標和疾病診斷生物標志物。蛋白質糖基化修飾主要包括N-鏈接糖基化和O-鏈接糖基化，其中N-鏈接糖基化約占70%。N-鏈接糖蛋白分布廣泛，從各種細胞表面到血清、腦脊液和尿液等不同的體液等。分泌在體液中的糖蛋白被認為是個體健康狀態一個特征窗口。這些特征使糖蛋白成為臨床和生物學研究中一類重要目標。蛋白質糖基化異常復雜，存在宏觀不均一性和微觀不均一性，因此使得糖蛋白組學研究尤其是N-鏈接完整糖肽的鑒定具有挑戰性。血清蛋白豐度的動態范圍較寬，糖基化蛋白質豐度低，完整的人血清N-糖數據庫的缺乏，加上存在非特異性酶切而產生不同的蛋白質變體，使得人血清N-糖蛋白質組學研究更具挑戰性。

　　該合作研究首先通過乙腈沉淀將血清蛋白分離為低豐度和高豐度的蛋白質兩部分。分別酶解消化后，通過親水相互作用色譜(HILIC)高效富集N-鏈接完整糖肽，部分糖肽用N-糖苷酶F（PNGase F）處理生成N-鏈接去糖肽。用LC-MS/MS分別分析N-鏈接去糖肽和完整糖肽。對于N-鏈接去糖肽數據集，采用常規序列庫搜索進行鑒定，考慮四種N-鏈接糖基化序列模體(NXS/T/C/V，X≠P)來識別N-鏈接去糖肽段。利用所鑒定的N-鏈接去糖肽的二級質譜構建了加入含有五糖核心的系列Y離子（Y1,Y2…Y5）的N-鏈接去糖肽段二級質譜譜庫。同時還構建了包含739個N-糖質量的數據庫。N-鏈接完整糖肽的鑒定采用基于譜庫搜索的策略，利用pMatchGlyco軟件、N-鏈接去糖肽段譜庫和N-糖質量數據庫對N-鏈接完整糖肽數據集進行系統地分析。相對于序列庫式搜索方法，譜庫搜索方法具有更高的靈敏度和更快的搜索速度。此外，通過母離子質量優化以及考慮半特異酶切和高豐度化學修飾，進一步提高鑒定靈敏度。最終共鑒定了526個N-鏈接糖蛋白、1036個N-鏈接糖基化位點、22677個N-鏈接完整糖肽和738個N-糖類型，使得人血清蛋白N-鏈接糖基化修飾分析和N-糖蛋白組學研究達到了新的高度。以血清中典型的糖蛋白轉鐵蛋白的N-鏈接糖基化修飾分析結果為例，該研究從血清中的轉鐵蛋白中共鑒定到4個N-鏈接糖基化位點（N432, N523, N630和N637），各位點所鑒定N-糖鏈類型數目分別為371、2、364和34個。從市售的人血清轉鐵蛋白對照品中共鑒定到5個糖基化位點（N432，N491，N523，N630和N637），各位點所鑒定N-糖鏈類型數目分別為559、5、6、547和117個。結果充分展示了糖基化修飾的微觀不均一性。

　　該工作是楊福全團隊和付巖團隊繼合作開發糖基化修飾分析軟件pMatchGlyco（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30186849）之后的再度合作。

圖：人血清N-鏈接完整糖肽鑒定策略與實驗流程。A：血清蛋白質樣品和N-鏈接完整糖肽樣品經過預分與不預分的處理過程；B：N-鏈接完整糖肽鑒定的數據分析流程。