這是構建cDNA文庫中最貴的一步，也是核酸質變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。反轉錄效率不高表現在一是部分mRNA被反轉錄了，但還有相當一部分本該反轉錄的mRNA未被反轉總的全長cDNA太少，這就難以構建好的全長cDNA文庫。少量程度的mRNA降解或反轉錄不完全在SMART 4等試劑盒及手工方法構建中對文庫的滴度影響不大，但對文庫的全長性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉錄的新技術（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證最終獲得全長cDNA的最好方法，但對mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結構和Poly A結構的全長mRNA且反轉錄完全，才能進入文庫中。反轉錄完成后點樣檢測cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。