枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備實驗——化學改進法

野生型枯草芽孢桿菌菌株BS501a

Spizizen salts母液CaCl2氨基酸GM II培養基GM I培養基MgCl2酵母粉K2HPO4·3H2O水解酪蛋白葡萄糖檸檬酸鈉蒸餾水KH2PO4MgSO4

微孔濾膜離心機錐形瓶離心管滅菌鍋搖床

一、實驗材料準備

1.  枯草芽孢桿菌感受態制備用貯存液
 

（1）10xSpizizen salts母液： 15% K₂HPO_4·3H₂O，6% KH₂PO₄，2% (NH₄ ) ₂ SO₄，0.2% MgSO₄，1% 檸檬酸鈉，溶于蒸餾水中，6.6 x10⁴ Pa高壓滅菌，室溫貯存。

（2）10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl₂， 6.6 x10⁴ Pa高壓滅菌， 酵母粉溶液最好現用現配，水解酪蛋白和
MgCl₂溶液可室溫貯存；20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl₂，用0.22 um的微孔濾膜過濾除菌，葡萄糖溶液和CaCl₂

溶液室溫貯存， 氨基酸溶液- 20℃ 貯存。
 

2.   枯草芽孢桿菌感受態制備用培養基
 

（1）GM I：1mL 10 xSpizizen salts， 0.1 mL，10% 酵母粉，0.25 mL 20% 葡萄糖，0.2 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸，補充滅菌蒸餾水至總體積10 mL。

 （2）GM II：1 mL 10xSpizizen salts，0.05 mL10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖，0.04 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸， 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl₂， 1 mL 25 mmo l/L MgCl₂， 補充滅菌蒸餾水至總體積10mL。

二、實驗步驟

1.  挑取一新鮮培養的野生型枯草芽孢桿菌菌株BS501a菌落接種于2.5 mL GMI培養基中，30℃，130-150 r/min振蕩培養過夜。

2.  將過夜培養物按10%接種量接種于2.5 mL新鮮的GM I中，37℃，200- 230 r/min振蕩培養3.5h。

3.  再將培養物進行第二次傳代， 接種于5 mL GMII培養基中，野生型菌株BS501a按5% 接種量進行第二次傳代，37℃，200-230 r/min振蕩培養90 min。

4.  取1mL培養物，5 000 r/min室溫離心5 min，用1 /10體積上清液重新懸浮細菌沉淀，即為枯草芽孢桿菌感受態細胞。