枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備實驗

枯草芽孢桿菌168

SPI 培養基 EGTA SPII 培養基 檸檬酸鈉 EGTA 氫氧化鈉 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖 酵母膏 ( NH4 )2SO4

培養箱 培養皿 錐形瓶 紫外分光光度計 接種環 離心管

一、試劑配制

1.  SP 鹽

0.2%( NH₄ )₂SO₄，1.4% K₂HPO₄，0.6% KH₂PO₄， 0.02% MgSO_4·7H₂O， 0.1% 檸檬酸鈉。

2.  CAYE (100x)

2% Casamino acid，10%酵母膏。

3.  SPI 培養基

SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100xCAYE 溶液。

4.  SPII 培養基

SPI 培養基加入1 %體積50 mmol/L CaCl₂ 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl₂ 溶液。

5.  SP-A Salts Solution(500 ml) 

（1）0.4% (NH₄)₂SO₄ ：2 g

（2）2.8% K₂HPO_4·3H₂O ：14 g

（3）1.2% KH₂PO₄ ：6 g

（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g

（5）121℃滅菌20 min。

6.  SP-B Salts Solution(500 ml)

（1）0.04% MgSO₄·7H2O： 0.2 g

（2）121℃滅菌20 min。

7.  100xCAYE Solution(100 ml)

（1）2% Casamino acid ：2 g

（2）10% Yeast Extract：10 g 

（3）121℃滅菌20 min。

8.  SPI Medium(20 mL)

 SP-A Salts Solution：9.8 mL

 SP-B Salts Solution：9.8 mL

 (1%V)Glucose(50%w/v，115℃滅菌20 min) ：200 uL

 (1%V)100xCAYE：200 uL

10.  SPII Medium(6 mL)

SPI Medium：5.88mL

(1%V)50mM CaCl₂ ：60uL

(1%V)250mM MgCl₂：60uL

11.  100xEGTA Solution

10mmol/L EGTA 溶液，溶解時需加少量NaOH 至pH8.0。

二、實驗步驟

1.  準備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37℃ 培養箱培養12 h。

2.  轉化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養基中，37℃，250 r/min 培養過夜。

3.  第二天上午取160 ul 培養液轉接至8 ml SPI 培養基中，37℃，250 r/min 培養至對數生長末期(168 約4-5 h)。

4.  取0.2 ml 生長至對數期末的培養液至2 ml SPII 培養基中，37 ℃，100 r/min 培養90 分鐘。

5.  在上述SPII培養基的菌體中加入20 ul 10mmol/L EGTA，再于37℃，100 r/min 培養10 分鐘。

6.  將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 ul DNA(DNA 量不能過高，不超過5 ug)，再于37 ℃，250 r/min 培養90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。

1.  注意儀器用品的干凈和無菌。

2. 8ml SPI 培養基要放于50 ml 離心管中培養，以保證菌體的生長狀態，不要使用玻璃試管。

3. 注意測定OD值，一定要等菌體生長至對數期后期。

4. 保證菌體的濃度，可以提高轉化率。