染色體提前凝集標本制備實驗

HeLa細胞                                                          

PEG                                                                  Hanks液                                                                  RPMI-1640培養基                                                                  小牛血清                                                                  秋水仙素                                                                  KCl                                                                  檸檬酸鈉溶液                                                                  次甲基蘭染液                                                                  PBS                                                                  Carnoy固定液                                                                  Giemsa染液                                                          

顯微鏡                                                                  離心機                                                                  水浴箱                                                                  熱吹風機                                                                  離心管                                                                  針頭注射器                                                                  試管架                                                                  染色槽                                                                  載玻片                                                                  酒精燈                                                          

1.  收集培養的M期HeLa細胞取一瓶處于對數生長期的HeLa細胞。

2.  向培養基中加入10 μg/ml 的秋水仙素使終濃度為0.04 μg/ml，在37℃二氧化碳培養箱內繼續培養12小時，使大量生長的細胞被阻斷于M期。

3.  每組取一瓶經上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復振搖，使培養液不斷沖涮細胞層（或用吸管吹打），M期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。

4.  將含有M期細胞的培養基移入離心管中，1 000 rpm 離心5分鐘，棄去上清加入5 ml Hanks液，用吸管吹打成細胞懸液。

5.  收集培養的HeLa細胞取一瓶生長良好的HeLa細胞，棄去培養基。

6.  加入少量0.25%的胰蛋白酶消化2~3分鐘，棄去胰酶消化液。

7.  然后加入5 ml Hanks液，用吸管吹打成單個懸浮細胞備用。

8.  50%PEG的制備

（1）稱取0.5 g PEG（MW4 000），倒入離心管中。

（2）在酒精燈上加熱使之融化（約為0.5 ml）。

（3）再加入預熱的Hanks液0.5 ml 混勻，放在37℃水浴中待用。

9.  細胞融合

（1）將上述1、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。1 000 rpm 離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液。

（2）用指彈法彈散細胞，在37℃水浴條件下吸取0.5 ml 50%PEG，逐滴加入離心管內，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90秒鐘。然后迅速加入5 ml Hanks液以終止PEG的作用。在37℃水浴甲靜置5分鐘。

（3）1 000 rpm 離心5分鐘。棄去上清，加入2 ml 有血清的RPMI-1640培養基，同時用針頭的注射器垂直加入10 μg/ml 的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。

10.  制備PCC標本

（1）細胞溫育后，1 000 rpm 離心5分鐘棄去上清，加入10 ml 0.075 mol/L KCl低滲液輕輕制成懸液。

（2）在37℃處理25分鐘左右；終止時加入1 ml Carnoy固定液進行固定，1 000 rpm 離心8分鐘，去掉上清。

（3）指彈離心管底部使細胞分散，加入10 ml Carnoy固定液固定30分鐘。

（4）1 000 rpm 離心5分鐘，棄去上清留0.2 ml，用吸管輕輕吹打成懸液。

（5）取預冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。

11.  結果觀察：在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細胞融合而誘導產生的PCC圖像，由于處于I期不同時相的細胞均能與M期細胞融合而被誘導產生PCC，因此有三種不同形態特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。

（1）形態特點分別是：

①G1期PCC為單線染色體，細長，著色淺呈蓬松的線團狀；

②S期PCC由于染色體解旋，DNA以多點進行復制，復制后的部分著色較深，以雙線染色體片段形式存在，故呈粉碎穎粒狀結構；

③G2期PCC因DNA復制完畢，所以可見凝集的雙線染色體，但較M期染色體細長。