染色體顯微切割實驗

RPMI1640完全培養基 秋水仙胺 固定液 Giemsa染液

倒置顯微鏡 玻璃針

一、顯微切割中期染色體的制備

1.取0.5mL外周血與含PHA的4.5mLRPMI1640培養液混合，在37℃培養細胞64?68h。

2.收獲細胞前20min在培養基中加入25ml秋水仙胺（10μg/mL)，繼續在37℃培養。

3.將細胞培養物移至15mL離心管中250g離心5min，然后小心棄上清。

4.用10mL低滲液重懸細胞沉淀，37℃水浴中溫育12?18min，250盡離心5min，棄上清。

5.用8mL新鮮配制的Camoy固定液輕柔地重懸細胞，將試管放置冰中至少2h，250g離心5min，然后小心棄上清。

6.用5mL固定液洗細胞2次，250g離心5min。

7.用0.5?1.5mL固定液重懸細胞，獲得有點不透明的懸液用于滴片。

8.滴2或3滴細胞懸液在干凈的呈45°角傾斜的蓋玻片上，隨液體的流動鋪勻整張片子，不要吹片子避免污染。

9.將片子在37℃無菌容器中可放置3?5d備用。

10.在顯微切割前完成用胰蛋白酶-Giemsa處理的標準G帶。用胰蛋白酶工作液在室溫中處理1?2min/將片子移至室溫條件下的Giemsa工作液5min，然后用蒸餾水漂洗片子，氣干。

二、顯微切割和拓撲異構酶I處理

1.在倒置顯微鏡下找到靶染色體，該顯微鏡有可隨意轉動的載物臺，以使靶染色體垂直于玻璃針的移動軸。如果可能，顯微鏡應放在防震的臺面上以減少振動。

2.用固定在顯微鏡上的顯微操作裝置控制的玻璃針切割靶染色體區域。

3.將玻璃針的針尖放置在靶DNA片段的正上方，然后向下移動玻璃針輕輕觸及該片段。利用靜電的力量將DNA片段吸到針尖，然后移動針尖到5μL收集液中。

4.在收集到預期數量（5拷貝）的切割DNA片段后，滴一滴礦物油覆蓋在收集液上。在顯微切割的DNA擴增前，用拓撲異構酶I 37℃處理1h使結構非常緊密的DNA解旋。

三、擴增切割的DNA

1.進行PCR啟動程序（5?8個循環，94℃、1min，30℃、2min，37℃、2min)，在每個循環的30℃時加入約0.3U的測序酶（13U/mL的測序酶用酶稀釋緩沖液稀釋1?8倍，在5μL的反應體系中加入0.2PL測序酶稀釋液)。

2.完成上述預擴增步驟后，在同一PCR管中進行Taq酶參與的常規PCR反應，PCR體系為50μL，PCR反應條件：94℃、1min，56℃、1min，72℃、1.5min的30循環，最后在72℃延伸5min。

3.加2μL第一輪PCR產物到另一個50μPCR反應體系中，進行20個PCR循環，反應條件同步驟2。

4.可用電泳分析識別處理的是否成功，將5μLPCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。PCR產物的大小范圍應在200?800bp。

四、熒光原位雜交

1.制備FISH探針，加2μL第二輪的PCR產物到與上述步驟相同的50μLPCR反應體系（除了加入終濃度為ZOμmol/L生物素-16-dUTP外）中，繼續PCR反應20個循環:.94℃、1min，56℃、1min，72℃、2min，最后在72℃延伸5min。

2.按照產品說明的步驟用B10-gel P6過濾柱上離心PCR產物，以去除未摻入生物素-16- dUTP。

3.用1/10體積3mol/L乙酸鈉和2倍體積乙醇在4℃沉淀探針20min。4℃條件下用10000g離心15min，用40μL TE緩沖液重懸探針。

4.FISH探針雜交是基于以前介紹的操作步驟基礎上。簡言之，對于每個雜交反應，大約100ng標記的探針混合于10μL雜交緩沖液（7μL雜交混合液、2μL探針和1μL人Cot1-DNA)中，在75℃變性5min，接著在37℃預雜交20min。

5.中期染色體標本需在72℃變性液中變性2min，然后將標本用70%、85%和100%的乙醇系列脫水。

6.將含有探針的雜交緩沖液滴在變性后的片子上，蓋上22mmX22mm蓋玻片，用橡皮膠封片。移至37℃濕盒中雜交過夜。

7.雜交完成后，移去蓋玻片，將片子用45℃洗液I洗3次，每次5?10min。

8.室溫下用洗滌液II洗3次，用洗滌液III洗1次，每次2min。

9.只含有直接標記探針的雜交可在此時進行分析。用生物素標記探針的雜交，用40μL含5μg/mL FITC-親和素的PNM緩沖液室溫處理20min。然后按步驟8洗滌標本。

10.染色體標本經40斗含5μg/mL抗親和素抗體的PNM緩沖液室溫處理20min，將熒光信號放大；然后按步驟8洗滌標本。

11.染色體標本通常用另一層的FTTC-親和素處理，處理條件同步驟9。

12.染色體標本經過70%、85%和100%乙醇系列脫水，空氣中干燥。用40μL含DAPI(1μg/mL)的抗淬滅劑液復染，蓋上蓋玻片，用裝有合適濾光片的熒光顯微鏡進行觀察

1.用Camoy固定液固定細胞（甲醇：冰乙酸=3:1);用固定液保存1年內的細胞可獲得高質量的FISH探針。

2.用于顯微切割的中期染色體標本片齡最好為3?14d;標本暴露于高溫環境（>60℃)或存放時間過長可降低切割產物的質量。

3.玻璃針是用一個自動化的、彈簧負載的移液管成型器制備。針尖斷點的直徑與染色體的寬度一致，針要放在無菌的培養皿中保存，每次使用前要用紫外燈照射5min，確保消除DNA污染。