染色體R顯帶技術

一、原理

R顯帶的機理目前并不完全了解，在高溫（80~90℃）的處理下誘發了染色體蛋白質的變化。Comings（1978）認為在高溫下G帶的中AT豐富區變性而顯出特別親染，但在R帶中正恰相反，AT豐富區卻并不顯出親染作用，故而顯出淺染帶區，電鏡的觀察進一步表明了這些帶和間帶區域的差異主要在于電子密度的不同，R帶所顯示之深淺帶紋區域正同G帶之帶紋區域相反，即G帶深染區R帶為淺染區，反之亦然。

由于這種技術所顯示深淺帶紋正好與G帶相反，故稱逆相G帶（Reverse G-band），故又稱R帶。在G帶染色體的兩末端都不顯示深染，而在R帶中則被染上深色，因此R帶有利測定染色體長度以末端區域結構的變化。目前所用的R顯帶方法是RBG法（R-band by BrdU using Giemsa），即經BrdU處理后用Giemsa染色。

二、操作過程

1.  標本制作是在常規外周血培養72小時之后進行的，然后，加入胸腺嘧啶核苷使其最終濃度為0.3 μg/ml，繼續培養17小時。

2.  無菌條件下，用Hank液洗二次，洗去胸腺嘧啶核苷余液，隨后將外周血培養物轉移入另一新鮮的培養液中，同時加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），使其生長培養液最終濃度為10微克/毫升，置于黑暗條件下在37℃中繼續培養5小時。

3.  終止培養：按常規外周培養量加入秋水仙素于37℃中繼續培養2~4小時，隨后按常規培養進行離心、低滲、固定、制片。

4.  制作R帶時，將玻片先放于Hoechst-33258工作液中染色20分鐘、或是在吖啶橙工作液中染色5分鐘，在用pH6.8磷酸緩沖液沖洗二次。

5.  將標本置于電熱金屬片上在恒溫水浴箱上，然后玻片上鋪滿了pH=6.8磷酸緩沖液，使液體保存于45度左右的恒溫。

6.  用8 W 紫外燈垂直于上述鋪滿了pH=6.8磷酸緩沖液的玻片上，燈管與玻片間距約5厘米，照射15~20分鐘，隨后用蒸餾水沖洗二次。

7.  將玻片浸于86度的Earle液中處理1~2分鐘，隨后用蒸餾水洗滌二次，冷卻。

8.  用1：20 Giemsa稀釋液染色10分鐘，晾干。

9.  鏡檢和核型分析：用低倍鏡轉油鏡觀察計數，然后選好的分裂相，經顯微攝影之后，按R帶染色體特征進行分析，以檢出異常。

三、注意事項

1.  染色體玻片不能用火烘干，只能讓其自然干燥其效果較佳。

2.  R顯帶制片不需經過高溫烘片，存放時間也不易過長。

3.  紫外燈照射時間與Earle液處理時間呈反比，如紫外燈照射時間長，則在Earle液中處理時間則短。