染色質免疫沉淀DNA分析

實驗概要

染色質免疫共沉淀是一種強力的方法，來聯系蛋白質或其修飾的定位與基因組的關系。染色質分離并用特異性抗體判斷是否與特異性  DNA 序列相結合。染色質免疫沉淀法亦可用來檢測目的位點在基因組中的時空分布（用芯片或 DNA 測序）。本操作規程詳細闡述了交聯染色質免疫沉淀  (X-ChIP) 實驗的具體步驟。

實驗步驟

1.   交聯和細胞收集

1)   取 2 個 150 cm²培養皿的融合細胞（每皿細胞數約 1 X 10⁷ - 5 X 10⁷ 個）。向培養基中滴加甲醛以使蛋白和 DNA 相交聯，甲醛的終濃度為 0.75%（體積百分比），室溫下輕輕搖動 10 分鐘。

2)   加入甘氨酸至終濃度為 125 mM，輕輕振蕩孵育 5 分鐘。

3)   用 10 ml 冷 PBS 洗滌細胞 2 次。

4)   用 5 ml 冷 PBS 刮下細胞，轉移至一個 50 ml 離心管中。

5)   用 3 ml PBS 洗滌培養皿，收集剩余細胞至 50 ml 離心管中。

6)   1000 g 離心 5 分鐘。

7)   小心吸棄上清液，用 FA 裂解緩沖液重懸沉淀（每 1 X 10⁷個細胞加 750 μl）。

2.   超聲

1)   將裂解液超聲處理以使DNA斷裂成約 500-1000 bp 的片段。不同的細胞系需要不同的超聲時間，因此需分別進行優化。

2)   超聲處理后，4 °C，8000 g 離心 30 秒使細胞碎片沉淀。將上清液轉移到新管中。此染色質溶液將用于步驟 4 的免疫沉淀 (IP)

3)   每個超聲后的樣本均取 50 μl，此樣本為抽樣樣本，用于定量 DNA 濃度（見步驟 3），并作為 PCR 的對照樣本。

3.   DNA濃度測定

1)   抽樣樣本用來測定 DNA 濃度，為后續 IPs 反應提供數據。用 PCR 產物純化試劑盒（加 70 μl 洗提緩沖液，轉至步驟 3.2a）或酚：氯仿（加 350 μl 洗提緩沖液，轉至步驟 3.2b）來純化 DNA。

2)   加入 2 μl RNA 酶 A (0.5 mg/ml)。置于 65 °C 恒溫振蕩 4-5 小時（或過夜）以解交聯。按照 PCR 產物純化試劑盒說明書來純化DNA。樣本可凍存于 -20 °C 冰箱中。

3)   DNA 濃度測定: 取 5 μl 純化 DNA，加入裝有 995 μl TE 的離心管中，200 倍稀釋，測定 OD₂₆₀。根據公式 DNA 濃度（μg/ml）= OD₂₆₀ x 10,000，計算每毫升染色質溶液中 DNA 的濃度。

4.   免疫沉淀

1)   使用步驟 2.2 中得到的染色質溶液繼續此操作。建議每個免疫沉淀反應 DNA 含量約為 25 μg 。每個樣本用 RIPA 緩沖液 1:10 稀釋。應設一個抗體對照和一個僅加磁珠的對照。

2)   除對照外，其余樣本中均加入一抗。事先應通過預實驗得到最佳的抗體加入量。一般來說，每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗體。

3)   所有樣本均加入 20 μl 的 A/G 蛋白磁珠（預吸附了單鏈魚精 DNA 和牛血清白蛋白，見步驟 4.3a），進行免疫沉淀反應，4 °C 旋轉過夜。

4)    A/G 蛋白磁珠與單鏈魚精 DNA 混合液的制備：如果使用 A 蛋白和 G 蛋白兩種磁珠，應將其等體積混合，并用 RIPA 緩沖液洗滌 3  次。吸棄 RIPA 緩沖液，加入單鏈魚精 DNA 至終濃度 75 ng/μl，同時加入牛血清白蛋白至終濃度 0.1 μg/μl。加入等體積  RIPA 緩沖液，常溫旋轉孵育 30 分鐘。用 RIPA 緩沖液洗滌一次，然后加入等體積 RIPA 緩沖液。

5)   將 A/G 蛋白磁珠離心，2000g 1 分鐘，棄上清。

6)   用 1 ml 洗滌緩沖液洗滌磁珠 3 次。2000g 離心 1 分鐘。

7)   用末次洗滌緩沖液洗 1 次。2000g 離心 1 分鐘。

5.   洗提和解交聯

1)   洗提 DNA：向 A/G 蛋白磁珠中加入 120 μl 洗提緩沖液，30 °C 旋轉 15 分鐘。

2)   2000g 離心 1 分鐘。將上清液轉移至新管中。樣本可于 -20 °C 保存。

3)   純化 DNA 可用 PCR 純化試劑盒（見步驟 3.2a）或酚:氯仿（加 280 μl 洗提緩沖液，然后參照步驟 3.2b）法進行。

4)   DNA 可用實時 PCR 進行定量檢測。可用實時 PCR 儀自帶的軟件進行引物和探針設計，或者使用在線設計工具進行設計。