柱層析操作時,先在圓柱管中填充不溶性基質,形成一個固定相。將樣品加到柱子上,用特殊溶劑洗脫,溶劑組成流動相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中,根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同,經多次反復分配將組分分離。