標準菌的復蘇、復壯及標準儲備菌株的制備

1、物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球

2、培養基

改良馬丁瓊脂培養基:用于黑曲霉復蘇、復壯.
液體硫乙醇酸鹽培養基:用于生孢梭菌復蘇、復壯.
營養肉湯培養基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、復壯。
改良馬丁培養基:用于白色念珠菌復蘇、復壯.

3、操作步驟：

a.打開潔凈工作臺。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風干。

c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。

d.以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。

e.輕輕地旋轉安瓿以使凍干菌種和液體培養基充分混合并完全溶解。

f.用無菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養基。

g.根據安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養于相應的溫度（細菌培養溫度30～35℃，培養18～24小時；真菌培養溫度23～28℃，培養3～5天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復蘇生長；若不渾濁，細菌應延長培養時間至7天，真菌應延長培養時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。

h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23～28℃培養5～7天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色，斜面側面無色，接近菌層培養基略帶黃色。確認后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。

i.取經復蘇后的上述細菌菌液8-10ml至液體培養基中按g項操作對菌種進行復壯。以無菌技術向復壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，1-2ml/管分裝于凍存管。每個菌種制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控制，即進行相應的確認。其余作為儲備管。黑曲霉的h項下洗脫液按h項下方法進行復壯，制成復壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術向復壯后的菌種中加入20ml 、30%的無菌甘油混勻，1-2ml/管封存于凍存管。制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控制，即進行相應的確認。其余作為儲備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。內容包括：菌種名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。

j．儲備菌種管制備成功，儲存于－20℃，有效期為三年。

4、菌種確認

用無菌接種環從質控管中取細菌培養物接種到營養瓊脂培養基平板上，或相應的宜于該細菌生長的鑒別平板上，劃線分離出單個菌落。然后在30～35℃下培養2～3天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板，并在23～28℃下培養7天；培養后，觀察其菌落形態，應符合該菌種形態特征。

5、污染處理

假如在該平板上發現有其他菌落生長，則說明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養物滅菌處理。可尋找原因重新分離挑選純菌落轉接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲備菌種管

6、菌種的傳代與保藏

將菌種接種至一新鮮培養基上，每萌發一次即稱為一代，因此，當原始菌種復溶并轉至新培養基內生長，即認為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代。

菌種的傳代保藏過程

3項下標準菌的復蘇為傳第一代，復壯為第二代。 傳第三代時取1支凍存管自然解凍，將其轉接斜面菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(W3)，一類用于實驗用（S3）。

定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：

（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘。

（2）將裝有新鮮配制的培養基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺，打開紫外燈照射一小時。

（3）關閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。

（4）右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。　

（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環伸入管內至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細菌接種在斜面的表面上。

（6）取出接種環，在火焰上方將培養基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環在火焰上燒灼滅菌。

（7）將已接種好的細菌管置30～35℃細菌培養箱培養22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培養箱最多培養7天。

當工作用菌種傳代代數小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進行銷毀。