標記抗體的應用技術——免疫斑點試驗

過氧化物酶底物

PBS甘油　DABAPAAP復合物

纖維素膜

一、辣根過氧化物酶免疫斑點試驗

　　　　　　　
1.  將0.01 M PBS PH7.4 稀釋的抗原液2 μl點于硝酸纖維素膜（或醋酸纖維素膜）上

2.  置37 ℃溫箱中干燥20～30 分鐘

3.  滴加封閉液37 ℃溫盒中封閉10 分鐘

4.  用洗滌液洗1～2 次，濾紙吸干

5.  加用稀釋液稀釋的抗體或待檢標本，置37 ℃濕盒中30 分鐘

6.  用洗滌液震洗3 次×3 分鐘、吸干

7.  水洗終止反應，觀察結果。出現明顯綜色斑點者為陽性

二、堿性磷酸酶免疫斑點試驗

　　　　　　　
1.  將0.01 M PBS PH7.4 稀釋的抗原液2 μl點于硝酸纖維素膜上

2.  置37 ℃溫箱中干燥20～30 分鐘

3.  用封閉液37 ℃濕盒中封閉10 分鐘

4.  用洗滌液震洗1～2 次，濾紙吸干

5.  加稀釋液稀釋的小鼠抗體或待檢標本，置室溫濕盒中30 分鐘

6.  用洗滌液震洗3 次×3 分鐘，吸干

7.  加1∶50稀釋的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，置室溫濕盒中30 分鐘、洗同前、吸干

8.  加APAAP復合物于膜上、室溫濕盒中30 分鐘，洗同前、吸干

　　　　　　　
9.  加1∶50稀釋的抗鼠IgG血清，置室溫濕盒中10分鐘，震洗1次、吸干

10.  加APAAP復合物，溫育、洗滌同“9”

11.  重復“9”和“10”1～3次

12.  洗滌液震洗3次×3分鐘、吸干

13.  滴加新配底物溶液顯色5～10分鐘，水洗中止反應，觀察結果

一、免疫斑點試驗的影響因素　

1.  包被N、C膜的抗原濃度對試驗結果影響較大。多以蛋白質含量500～1000 μg/ml為宜。濃度過高可出現假陽性，過低則降低試驗的敏感性。

　　
2.  酶結合物濃度對試驗成功與否至關重要。最適濃度常與包被抗原濃度有關，應根據試驗具體條件作方陣滴定來確定。

　　
3.  顯色時間，一般認為5-10 分鐘較好。顯色時間過長常導致本底著色加深，降低試驗的特異性。

　　
4.  用抗原包被NC檢測抗體時，待檢樣品加樣不宜過多。加樣過多可使相鄰的樣品混淆，一般5～10 μl即可。