哺乳動物核移植技術研究進展哺乳動物核移植是將外源的一個細胞核與一個去核卵母細胞結合，產生遺傳上同質的動物的技術。它在動物育種、制備轉基因動物、基因治療及器官移植等方面具有重大的作用。
1、供體核的獲得
供體核可以是早期胚胎細胞、胚胎千細胞和體細胞。早期都采用合子核到64細胞期的胚胎細胞核質體分裂球作供體細胞核，80年代開始，隨著胚胎干細胞（embryo stem cells，ES）的建立和對其研究的深入，人們對胚胎干細胞在核移植方面的應用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。Teruhiko Wakayama等利用ES系克隆小鼠，結果有29%的重構胚在體外能發育到囊胚階段，移植給假孕小鼠有8%胚胎附植并產下小鼠。1997年Dolly羊的出現，開始了體細胞的核移植，并發展很快。
（1）胚細胞
用0.2%鏈霉蛋白酶預處理胚胎，溶去胚胎的膠膜及透明帶，分離出單個卵裂球。消化透明帶的時間是影響卵裂球質量的重要因素，作用時間短，透明帶不能充分消化，卵裂球不易獲得；作用時間長，則影響到卵質膜，容易破裂，在操作時容易失敗。因此，在分離卵裂球時應在解剖鏡下監視透明帶的消化過程，當透明帶變薄，膨脹適度時就應移出，再用適當口徑的吸管吹打使之分離。另外，蘇格蘭學者Campbell等顯微分離胚盤細胞并在體外進行缺血饑餓傳代培養，誘使細胞處于“靜止”狀態，以便調整染色體結構，從而有助于核的重組與發育，他們使用這種方法建立了綿羊TNT4細胞系，該細胞形態類似于胚胎干細胞，但更扁平、上皮化。
（2）體細胞
最早用青蛙腸粘膜上皮細胞獲得了后代。Wilmut等用綿羊乳腺細胞獲得Dolly羊。美國夏威夷大學Ryuzo Yanagimachi教授領導的一個國際科研小組于1998年以小鼠卵丘細胞為核供體，采用吸移管注入，利用機械和化學激活方式進行細胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。對小鼠、牛體細胞移植的相關研究中發現休眠（G0）的顆粒細胞核與去核MⅡ期卵母細胞構成的體細胞重構胚，其發育率及產生克隆后代的能力遠高于其它類型的休眠體細胞，這可能緣于顆粒細胞上存在著與卵母細胞緊密聯系的胞質微絨毛橋的緣故，它或許有助于供體核同受體核胞質因子的交換。
2、受體細胞去核
作為細胞核移植的受體細胞主要有三類：去核的卵母細胞、受精卵和2-細胞胚胎，其中卵母細胞應用最為廣泛。有人用兩個去核卵母細胞融合后產生的胞質作為受體進行各代核移植，以增核移植胚胎的細胞數和提高繼代移植效率。研究證明，體外成熟培養的卵母細胞核移植成功率不如體內成熟的卵母細胞，其原因可能是卵母細胞在體外成熟過程中，需要合成一些蛋白質來完成第一次減數分裂，體外成熟的一些卵母細胞其活動有可能受到抑制。
核移植
（1）盲吸法
用微細玻璃管在第一極體下盲吸，吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周圍的部分細胞質，但該方法成功率低。為提高去核率，利用Hoechst33342染料對染色質的特異性染色作用，在熒光顯微鏡下去核后判斷去核是否完成，去核準確率大為提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml）染色，在紫外線下照射的時間控制在10s以內，未觀察到對胚胎發育的負面影響。
（2）半卵法
用微細玻管針在透明帶上做一切口后，用微細玻管吸去一半染色質至另一半空透明帶內，即將卵母細胞分為兩半，然后用Hoechst33342染色，確定不含染色體的一半為細胞質受體。其操作方法如下，將卵母細胞移入35mm含有mPBSA（磷酸緩沖液，其中有D-葡萄糖1000mg/l、丙酮酸36mg/l、0.4%牛血清白蛋白、1%青霉素和鏈霉素10000μg/ml）的皮氏培養皿中進行顯微操作，首先分兩步進行分割透明帶，即先在透明帶上切一小口，然后用另一切割針擴大切口，從而分割透明帶。透明帶被切除后轉移到含有mPBSA+5μg/ml細胞松弛素B的35mm的皮氏培養皿中作用3一5min，然后用固定針(內徑為透明帶的l/5一1/3，外徑接近透明帶的直徑）固定，分割針進入透明帶的隙口中并將該針固定在靠著透明帶的地方，緩慢吸取卵母細胞液，當分割針中吸取了一半卵母細胞液時，這時將該針從卵黃隙中移出，并靠著透明帶切割邊緣輕微地擦過以達到完全的分割，將其針中的卵母細胞液移入準備好了的空透明帶中，并用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察不發熒光的作為受體卵母細胞。
（3）離心去核
Tatham等以15000g、2min離心牛卵母細胞，用鏈霉蛋白酶去除卵母細胞透明帶（ZP），經滲透壓梯度離心，MⅡ期紡錘體可從大多數卵母細胞中分開，把無透明帶的去核胞質作核移植的供質，同分裂球聚集經電融合成核移植胚，最后放入藻酸鈉假透明帶中，能在體外卵裂和發育，但其效果還有待于進一步研究。
（4）末Ⅱ期去核法
Bordignon等提出把卵母細胞先激活使之處于末Ⅱ期，在排出第二極體時吸出第二極體及周圍的少量細胞質，從而達到去核。這種方法避免使用DNA染料和經紫外線照射來定位染色體，并且去除的細胞質相對較少。該去核方法比MⅡ期去核的成功率有顯著提高，但這種細胞質容易老化，是否能對基因組完全重排序，順利完成后期發育，有待于研究。
多數研究者在多數卵母細胞出現第一極體的成熟時期去核，去核時間，體內成熟在發情開始后48h，體外成熟22－24h。卵母細胞去核程序與重構胚中再程序化狀況密切相關，去核率越高，其克隆胚最終發育成正常胚的可能性越大。去核率的高低與卵母細胞所處的成熟時期以及所采用的方法密切相關。以前的核移植研究均采用未激活的卵母細胞作為核受體，并認為激活后卵母細胞的重排能力會下降，影響核移植的效率。但Ushijima，等和Terlovw等；研究表明，激活后的卵母細胞作為核供體時，重構胚融合和發育能力均優于融合激活同時進行的效果。
3、核卵重組
在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細胞的間隙中，根據移人的部位不同，可分為帶下移植和細胞質內注射。那些卵裂球很難分離的胚胎可以在添有鈣和鎂-游離的磷酸緩沖鹽溶液的mPBSA中孵育30－60min使細胞分裂停止。但孵育時間超過60min，細胞膜的完整性將遭到破壞，操作過程中細胞的溶化率將增加。在移植針移開后，對移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與半卵母細胞接觸。
4、細胞融合與激活
核移植
由于微吸管破壞了卵膜和一部分細胞質，若直接移植，成功率很低，故需對重組胚融合，其采用的方法有仙臺病毒法、物理或化學方法（如電融合法、鈣離子載體、乙醇、蛋白質酶合成抑制劑等）激活受體細胞，使其完成細胞分裂和發育過程，電融合法更常用。電融合時選擇的電壓范圍和脈沖頻率取決于融合箱中兩個電極的距離。融合箱的距離由200μm，到幾毫米，因此在脈沖是200μsec倍數且能傳導lKV/cm的直流電基本滿足要求。對小鼠、家兔等實驗動物進行胚胎核移植時還發現，受體卵母細胞在重構胚電融合時被激活的狀態與重購胚的發育率密切相關，脈沖強度為2.0-3.6K/cm、融合時間為60-200μsec是適宜范圍。若脈沖過強，融合時間過長，對重構胚的進一步發育極為不利。Kono等提出針對不同時期的供體核采取不同激活程序得到了較好的實驗結果：①對于G2期和M期的供體核即4倍DNA供體，在融合時可采用不引起卵母細胞活化的仙臺病毒或細胞質內注射，然后再給予激活處理，使一半DNA以極體方式排出，隨后形成原核及正常2倍體細胞，應用此法已產生了正常的小鼠；②對于G0、G1及S期供體核，可采用融合前激活和融合時激活兩種方式，以防止供體核形成中期板而導致染色體的不正常。Szollosi用小鼠胸腺細胞作核移植實驗時發現，只有成熟的去核卵母細胞被激活前或激活后30min進行融合，移入的供體細胞核才發生降解，并重新聚合形成新核膜，若超過30min再觸合，雖然移入的供體核才發生降解，這可能會使供體染色質與受體細胞質諸因子的有效互作受到抑制，從而使再程序化過程受阻。Wakayama等人利用受體卵母細胞化學激活和重構胚化學融合的方法，也在小鼠體細胞克隆和再克隆的研究中取得了理想的結果。
對兔卵電融合完成后，卵母細胞也因電刺激受到激活從而開始新的編程和發育，但對小鼠、大鼠和牛等還需進一步充分的激活才能獲得發育。其方法有化學和電激活兩種，化學激劑有7%乙醇、Ionomycin（離子霉素）、鈣離子載體A23187，采用Ionomycin激活后再用6-DMAP處理3h，可避免出現PCC（早熟染色體凝集），并增加羊重構胚的發育率及出生率。
5、重構胚培養與移植
核移植
重構胚需一定時間的培養，方可移植到受體，家兔和豬重構胚在體外培養24h以內，就可通過非手術移植，而羊和牛重構胚所需培養時間較長，一般發育到囊胚或桑堪胚時移植。培養的方法是可將電融合的重構胚放大10%FCS的RD微滴內培養，也可將顯微操作的胚胎移入同種或異種的輸卵管中進行培養，幾天后沖洗輸卵管，回收重構胚。后者的實驗方法如下，先用瓊脂和0.9%NaCI制成1.0%和1.2%瓊脂糖，將1.0%的瓊脂倒入35mm的皮氏培養皿中，當溫度為37℃時將胚胎移入瓊脂塊中。應用瓊脂切割針吸取一氣泡和mPBSA+20%新生犢牛血清，然后吸取含有瓊脂的胚胎，該針在室溫下保持幾秒鐘后將其放入MPBSA+20%新生犢牛血清的皮氏培養皿中。當1.2%的瓊脂溫度達到37℃時，采用同上的方法在瓊脂糖中洗滌幾次，然后組成雙層瓊脂并采用手術移植到輸卵管中。在體外進行重構胚的培養時，選擇適當的培養液非常重要。重構胚的移植與胚胎移植的方法基本一樣，即根據受體動物的不同可分為手術移植和非手術移植。