在許多反轉錄病毒中與多功能酶的反轉錄酶有關，在病毒基因組進入DNA轉錄的不同階段執行重要的功能。在真細菌中，核糖核酸酶H確信在以下方面是所必需的：從Okazaki片段去除RNA引物時、在轉錄子進入DNA聚合酶I啟動DNA合成所用引物的轉錄過程時，以及在去除R-環為在大腸桿菌染色體復制起點提供不規則DNA合成的條件性啟始位點。在真核細胞中核糖核酸酶H也可能執行類似的功能。
已有報告講核糖核酸酶H可明顯增加反義寡脫氧核糖核酸對基因表達的抑制。這些寡核苷酸和mRNA中的特定序列的雜合子對此酶的降解敏感。核糖核酸酶H在體外起動對在Colicin E1( pColE1)型質粒的原始部位(Ori)的復制是必須的。此酶似乎也抑制啟動非Ori部位的DNA合成。
X射線晶體成像分析顯示：大腸桿菌核糖核酸酶H含有兩個功能區；其中一個含Mg2+結合位點，與一種前不久在DNA酶I被認識的折疊β鏈吻合。