實驗材料 cDNA0.45um 硝酸纖維素 尼龍膜 酵母 tRNA
試劑、試劑盒 PBS NP-40 裂解緩： 20XSSC LNaOH 甘油儲存緩沖液 10X 轉錄緩沖液 核苷酸:ATPGTPCTP 200uCi「α32P]-UTP 10XSET 蛋占酶 K 無 RNase 的 DNase CaCI2 硫氰酸胍溶液 Tris-SDS 緩沖液 水飽和酚 氯仿異戊醇 無水乙醇 異丙醇 乙酸鈉
儀器、耗材 紫外交聯儀 D 狹縫印跡裝 雜交箱
實驗步驟
一材料與設備
1)cDNA
2)PBS
3)NP-40 裂解緩：0.5%NP-40,10mmol/LTris-HCl(pH7.4)，3 mmol/LMgCl2,10 mmol/LNaCl
4)20XSSC:3mol/LNaCl,0.3mol/L 檸檬酸鈉 (pH7)。
5)1mol/LNaOH
6) 甘油儲存緩沖液：40% 甘油，50 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 0.5 mmol/L MgCl2, 0.lmmol/L EDTA
7)10X 轉錄緩沖液：l00 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，50 mmoI/LMgCl2，800 mmol/LKCllmmol/LEDTA,5 mmol/LDTT
8) 核苷酸:ATP,GTP，CTP
9)200uCi「α32P]-UTP:3000Ci/nmol。
10)10XSET;5%SDS，50 mmol/LEDTA，50 mmol/LTris-HCl(pH7,4)
11) 蛋占酶 K
12) 無 RNase 的 DNase:1Omg/mL
13)CaCI2：20 mmol/L
14) 硫氰酸胍溶液:4mol/L 硫氰酸胍，25 mmol/h 檸檬酸鈉 (PH7.0),0.5%Sa rcosyl0.lmol/L2-疏基乙醇
15)Tris-SDS 緩沖液：Tris-HCl(PH7.2),1 mmol/LEDTA,0.1%SDS
16) 水飽和酚
17) 氯仿：異戊醇 (49:1)
18)0.45um 硝酸纖維素/尼龍膜，
19) 無水乙醇。
20) 異丙醇。
21) 酵母 tRNA:10 mg/ml。
22) 乙酸鈉：2mol/L
23) 紫外交聯儀 D
24) 狹縫印跡裝
25) 雜交箱。
二、操作方法
下面每一步均在 0-4°C 進行
1）用冷的 PBS 洗 1X107-5X107 個細胞，1500 g 離心 5 min 收集細胞。
2) 去除上清，重懸細胞于 PBS 中，1500 g 離心 5 min 收集細胞。
3) 去除上清，加入 4 mlNP-40 裂解液，溫和渦漩振蕩, 冰上放置 10 min
4) 于 4℃,400 g 離心 10 min 沉淀細胞核。用 NP-40 裂解液洗滌一次.
5) 用 200ul 甘油緩沖液重懸沉淀，在顯微鏡下觀察細胞裂解情況。
6) 分裝，凍存于液氮中。
(二）核轉錄
1) 在無菌離心管中加入：3X107 個細胞核，35% 甘油，20ul1OX 轉錄緩沖液，4 mmol/LATP，GTP，CTP,200uCi(α32P]-UTP, 加蒸餾水至 200ul 于 26°C 溫育 10 min
2) 加入 10ul_DNase1，10ul20 mmol/LCaCl2，于 26℃ 溫育 lOmin，酶切核 DNA。
3) 加入 2ul 蛋白酶 K,25ul10×SET,5ul 酵母 tRNA，于 37℃ 溫育 30 min。
4) 加入 550ul 硫氰酸胍溶液，90ul2mol/LNaAc，900ull 水飽和酚，180ul 氯仿/異戊醇，置于冰上 15 min。
5) 于 4℃,12000 g 離心 15 mm, 吸出水相。
6) 加入等體積異丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h。
7) 于 4℃12000 g 離心 15mim 用 300ul 硫氰酸胍溶液溶解沉淀，
8) 加入等體積異丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h,
9) 與 4℃12OOOg 離心 15mim, 用 70% 乙醇洗滌沉淀，用 1 mlTris-SDS 緩沖液溶解沉淀。總活性為 1X107-2X107cpm。
(三) 雜交分析
1) 在 100ul 的 25ug cDNA 探針或 50ug 線性質粒中加入 10% 體積的 lmol/LNaOH，使之變性。
2) 溫育 15 min, 用 10 倍體積 6XSSC 中和。
3) 剪裁大小合適的硝酸纖維素/尼龍膜。用 0.4mol/LTris(PH7.0) 溶液將膜浸泡30 min, 而后將膜置于狹縫印跡裝置上。
4) 將 1-5ug DNA 加至膜上，真空狀態下于 80℃ 烘烤 2 h 或紫外交聯 2 min。
5) 按常規方法進行預雜交，雜交。
6)X 射線片，顯影分析。
注意事項
1) 洗膜的時間可根據實驗確定. 上要考慮使用的探針的性質和力求蕕得最小背景。
2) 細胞核的質量是核失控轉錄測定的關鍵。Dounce 勻漿器有助于制備不易被 NP40 裂解的細胞的核。
慕尼黑上海分析生化展（analyticaShanghai）是世界分析、實驗室技術和生化技術領域的旗艦盛會analytica的在華子展，專門面向飛速發展的中國市場。憑借著analytica的國際品牌，a......
亞洲重要的分析、生化技術、診斷和實驗室技術博覽會——第十三屆慕尼黑上海分析生化展（analyticaShanghai2026）將于2026年11月16-18日在上海新國際博覽中心N1-N5&E......
政府采購意向公告 中國科學院大連化學物理研究所2025年6月政府采購意向為便于供應商及時了解政府采購信息，根據《財政部關于開展政府采購意向公開工作的通知》（財庫〔2020〕10號）等有關規定......
為便于供應商及時了解政府采購信息，根據《財政部關于開展政府采購意向公開公正的通知》（財庫〔2020〕10號）等有關規定，現將華中師范大學2025年5月至6月政府采購意向項目公開如下：本次公開的采購意向......
為促進首臺（套）重大技術裝備創新發展和推廣應用，根據天津市重大技術裝備的發展現狀，在廣泛征求相關重點企業意見基礎上，經組織行業知名專家評審論證，天津市工業和信息化局制定了《天津市首臺（套）重大技術裝備......
2024年11月18日，實驗室行業的璀璨盛會——慕尼黑上海分析生化展（analyticaChina）和上海實驗室規劃建設與管理大會（labtechChinaCongress）在新國際博覽中心盛大揭幕。......
2024年12月12-13日“第七屆中國武漢光谷生物學術年會暨生物制藥質量分析技術論壇”聚焦新型疫苗質量工藝開發，蛋白/納米抗體ADC質量與工藝，核酸藥物領域的最新動態、生產工藝變革等內容，實現深度交......
會議簡介為推動我國分析科學與儀器領域自主創新和高質量發展，加強產學研用協作，促進分析科學基礎研究和儀器研發，提升人才培養和企業發展的水平，中國分析測試協會決定于2024年11月8-12日在成都召開“首......
2024年8月8日，第十八屆全國青年分析測試學術報告會于廣西壯族自治區桂林市成功舉辦。本次大會由中國分析測試協會主辦，得到廣西師范大學省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室、化學與藥學學院、......
最近，罐車運輸食用油亂象問題備受關注。7月9日，國務院食安辦對此亂象問題也作出了回應：將組織國家發展改革委、公安部、交通運輸部、市場監管總局、國家糧食和儲備局等部門召開專題會議研究，成立聯合調查組徹查......