1. 核苷酸轉移作用。
2. 水解反應，即磷酸二酯酶作用。
3. 磷酸轉移反應，類似磷酸轉移酶作用。
4. 脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。
5. RNA內切反應，即RNA限制性內切酶作用。
核酸內切酶可以催化水解多核苷酸內部的磷酸二酯鍵。有些核酸內切酶僅水解5′磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在3′位置上，稱為5′-內切酶；而有些僅水解3′-磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在5′位置上，稱為3′-內切酶。能專一性地識別并水解雙鏈DNA上的特異核苷酸順序，稱為限制性核酸內切酶（restriction endonuclease，簡稱限制酶）。當外源DNA侵入細菌后，限制性內切酶可將其水解切成片段，從而限制了外源DNA在細菌細胞內的表達，而細菌本身的DNA由于在該特異核苷酸順序處被甲基化酶修飾，不被水解，從而得到保護。限制性核酸內切酶可被分成三種類型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過在特殊堿基上補加甲基基團對DNA進行化學修飾的活性。Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修飾DNA，能在所識別的特殊核苷酸順序內或附近切割DNA。因此，被廣泛用于DNA分子克隆和序列測定。