核酸親和層析法純化蛋白質實驗2

樣品蛋白質

平衡緩沖液（Tris-HClKClEDTA）非特異 DNA

在上樣品液到核酸親和柱之前，建議首先采用其他的純化方法，如硫酸銨沉淀、離子交換或凝膠過濾層析等富集目的蛋白。這樣可以除去絕大多數的污染物，并減少非特異結合。親和層析柱一般來講是短而粗的，例如長寬比為 2：1。

1. 10 倍柱體積的平衡緩沖液（20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，0.15 mol/L KCl，1 mol/L EDTA）平衡柱；

2. 調整樣品液到相似的離子濃度（即 0.15 mol/L KCl）；

3. 加非特異 DNA 到樣品液內，每 ug 純蛋白質加 100 ng。混勻后在冰上孵育 10 min。非特異 DNA 長度通常是 1 kb 左右，可以是 poly（dI-dC）或 poly（dA-dT），也可以是超聲破碎的大腸桿菌、牛胸腺或鮭魚精 DNA。為了除去孵育后可能形成的復合物，需 10 000×g 離心 10 min 棄去沉淀；

4. 緩慢地將樣品液上樣到親和柱，流速 15 ml/h；

5. 5 倍體積平衡緩沖液洗柱；

6. 分別用 1 倍體積各含 0.2、0.3、0.6 和 1.0 mol/L KCl 的平衡緩沖液洗脫目的蛋白；

7. 檢測各收集組分的活性，并匯集有特異活性的組分。因為蛋白質濃度時常較低，故常加入非離子型去垢劑 Triton X-100（終濃度 0.05％）以減少容器壁對蛋白質的吸附。需要注意的是該去垢劑會干擾 A₂₈₀ 測定；

8. 在 -70℃ 儲存活性目的蛋白組分；

9. 用 10 倍體積的含 2.5 mol/L NaCl 和 0.5 mol/L EDTA 的平衡緩沖液洗柱使親和柱再生。然后用含 0.02％ NaN₃ 的平衡緩沖液再平衡后將柱 4℃ 儲存。