核酸內切酶的影響及因素

　　限制性酶切反應速度與底物的性質有很大的關系，底物的單雙鏈結構、分子的構型、DNA鏈中酶識別位點的數目以及位點附近的序列等都影響著酶的催化反應。共價閉合環(超螺旋構型)DNA比其相應的線性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋構型DNA徹底降解，需要的酶量就大。對于DNA-RNA雜合雙鏈的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8種酶切時，結果其 DNA鏈可被切割，但酶用量比雙鏈DNA大20-50倍。部分限制性酶還可切割單鏈DNA，如 Hae Ⅲ等。

　　每一種限制性酶都有自身的識別特異性，在通常酶反應條件下，特異性不會改變，但在特殊條件下，某些酶的特異性會隨之改變，如當反應緩沖液的pH由7.5升高至8.5，或甘油濃度超過5%，或用Mn艸代替Mg艸時EcoRI的識別序列由原來的GAATTC變為AATT，結果是DNA鏈上切點數量增加，產物片段變小，因此在不合適的反應條件下，限制性酶可表現與原來特異性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要確保酶解條件，注意底物DNA的純度，盡可能防止酶的第二活性。

　　反應液中鹽的濃度是至關重要的，因此要根據所使用的酶來確定鹽的濃度。限制性酶對鎂離子的要求并不嚴格，5-30mmol/L均可作用。限制性酶的用量，一般為每微克DNA 1-5單位，為保險起見以過量3-5倍為宜，但最好先作預實驗。

　　從理論上講，延長反應時間可以節省酶，但長時間消化受酶的穩定性、雜酶的影響等因素的制約。國產酶不宜超過1.5小時，其他酶一般也以1-2小時為宜。酶切反應的溫度一般在 37℃，只有少數酶要求特殊反應溫度，如TaqⅠ要求65℃。低于37℃時大部份酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。許多酶可用熱處理(65℃)10-15分鐘使酶反應終止，但并非所有酶都能熱終止，不能熱終止的酶可用過量EDTA終止或用酚提取來終止。