核酸內切酶的操作步驟及應用

　　1.操作步驟 以動物病毒為例說明酶切反應步驟。

　　(1) 病毒DNA的提取和純化 當繁殖病毒的細胞出現80%-100%的細胞病變時(CPE)，收獲并凍融三次使細胞破裂釋放出病毒，3 000r/min離心10分鐘，吸出上清，加10% SDS至終濃度為1%，于56℃水浴作用30分鐘，加等體積的飽和酚，混勻10 000r/min離心10-15分鐘，取上清反復抽提至界面無蛋白質為止，取上清用乙醚去酚數次，真空除去乙醚，然后加2.5倍預冷無水乙醇，沉淀核酸，12 000r/min離心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗滌兩次，pH8.0 TE緩沖液溶解，取少量用紫外分光光度計測其含量和純度，其余置－20℃貯存備用。

　　(2) 酶切反應 將病毒DNA用TE溶解為大約0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切緩沖液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/ L MgCl2，1mmol/L DTT），5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用滅菌雙蒸水補足至50μl，在振蕩器上溫和振蕩幾秒鐘，然后稍稍離心(3 000r/mmin)數秒，以使管壁液體集中于管底，37℃恒溫水浴中孵育1小時，65℃水浴作用10分鐘，或用EDTA終止反應。

　　(3) 電泳 依據酶切片段的大小選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠作為支持物進行電泳，同時加入標準DNA作分子量參照物，經溴乙錠(EB)或硝酸銀染色，在相應的光源下觀察結果并拍攝記錄電泳圖譜。

　　以上為酶切反應操作的基本過程。如果進行多酶切反應，則要考慮反應緩沖液要基本適用于所用的各種酶。若兩種以上的酶對緩沖液要求不同，如鹽濃度要求不同時，先進行低鹽要求的酶切反應，再進行高鹽要求的反應，對反應溫度要求不一的也是先進行低溫度酶切，再進行高溫度酶切。

　　2.酶切分析應用限制性核酸內切酶在分子生物學研究中占有極其重要的地位，幾乎每一個研究領域都離不開限制性內切酶，其應用非常廣泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，將龐大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重組和組建新質粒；建立DNA的物理圖譜等。

　　用限制性內切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis REA)病原微生物DNA已成為一種常用的方法，通過酶切消化DNA，然后電泳染色呈現大小不一的片段，對這些片段的遷移率及數量進行分析，便可了解到病原微生物遺傳物質的一定特性，在此基礎上采用雙酶切割或雜交等方法，則可推測出片段的排列順序和酶切位點，從而推斷出DNA間存在的相似性或差異性，對于動物病毒尤其是對疫苗毒、野毒及變異毒株的檢測具有重要的意義。