核酸的定量測定實驗——二苯胺法

DNA 分子中2-脫氧核糖殘基在酸性溶液中加熱降解, 產生2-脫氧核糖并形成ω-羥基-γ-酮基戊醛, 后者與二苯胺試劑反應生成藍色化合物, 其反應為：
 

藍色化合物在595 nm 處有最大吸收峰, 且DNA 在40～400 μg 范圍內時, 光密度與DNA 濃度呈正比。在反應液中加入少量乙醛, 可以提高反應靈敏度。

蛋白質

小牛胸腺DNANaOH二苯胺純冰醋酸過氯酸乙醛

試管吸量管容量瓶722 分光光度計

1.  標準曲線的繪制: 取干燥試管6 支, 編號, 按下表加入試劑。

加完后混勻, 于60 ℃恒溫水浴中保溫1 h , 冷卻后于595 nm處比色測定, 以零號管調零點。以DNA 濃度為橫坐標, 光密度為縱坐標, 繪制標準曲線。

2.  樣品測定: 取試管3 支, 兩支為樣品管, 一支為對照管。對照管操作與標準曲線零號管相同。向每支樣品管加2.0 ml 樣品液及4.0 ml 二苯胺試劑, 60 ℃ 保溫1 h , 冷卻后于595 nm 處比色測定, 以對照管調零點。根據測得的光密度值從標準曲線上查出相應光密度的DNA 含量, 按下式計算DNA 百分含量。