核酸探針標記及原位雜交1

一、核酸探針標記

核酸探針分子雜交是指具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。

核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針；根據標記物不同，可分為放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類；根據是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。下面主要介紹雙鏈DNA探針及其標記方法和光敏生物素標記探針的方法。

(一)切口平移法(nick translation)標記雙鏈DNA探針

當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3?蒺羥基末端。同時該酶具有從5?蒺→3?蒺的核酸外切酶活性，能從切口的5?蒺端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3?蒺端補上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50～500bp。切口平移反應受幾種因素的影響：① 產物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度；② DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小；③ DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性，故應使用仔細純化后的DNA。
1.材料

（1） 設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。 　　

（2） 試劑： ①10×切口平移緩沖液：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.2)；0.1mol/L MgSO4；10mmol/L DTT；100μg/ml BSA。②未標記的dNTP原液：除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外，其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中，濃度為0.3mmol/L。③[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP 400 Ci/mmol, 10μCi/μl。④ E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4U/μl)溶于50μg/ml BSA，1mmol/L DTT，50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。⑤DNA酶Ⅰ1mg/ml。⑥EDTA 200mmol/L(pH8.0)。⑦10mol/L NH4Ac。

2.方法

（1）按下列配比混合：未標記的dNTP 10μl、10×切口平移緩沖液5μl、待標記的DNA 1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl、E.coli DNA聚合酶4U、DNA酶Ⅰ1μl，加水至終體積 50μl；

（2）置于15℃水浴60min；

（3）加入5μl EDTA終止反應；

（4）反應液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L，加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。 　　

3.注意事項

（1）3H、32P及35S標記的dNTP都可用于探針標記，但通常使用[α-32P]-dNTP。

（2）DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。