3.注意事項
（1）避光下準備反應體系：由于光敏生物素醋酸鹽對光敏感，應避免光照。在分裝試劑及核酸與光敏生物素混合時應在暗室安全燈下操作。
（2）核酸純度：由于光敏生物素能與任何有機物反應，因此用做標記探針的核酸要高度純化。用作標記探針的核酸最好不用Tris溶液溶解，Tris中所含氨基會干擾標記。
（3）光照標記時間：光照時間不應太長。如果核苷酸上標記光敏生物素過多，會因空間位阻而影響探針與靶序列的雜交。一般認為，每100～400bp標記上一個光敏生物素分子。此法適用于大于200bp的核酸片段的標記，小片段標記率不高。
（4）光敏生物素用量：光敏生物素的活性基團是堿基，反應中加量不能太多，否則會產生氮氣泡。一般為1 μg DNA用1～2μg光敏生物素。
二、原位雜交
原位雜交（in situ
hybridization）用特定標記的已知堿基序列核酸作為探針與組織、細胞中待檢測核酸按堿基互補配對的原則在原位進行特異性結合，形成雜交體，然后用與標記物相應的監測系統，通過免疫組織化學方法在被檢測核酸原位進行細胞內核酸定位。原位雜交可根據檢測物而分為細胞內和組織切片原位雜交；根據其用探針及檢測核酸的不同可分為DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA雜交。根據標記方法不同可分為放射性探針和非放射性探針。
其基本方法包括：固定、切片、雜交、顯色等主要步驟。
(一)取材與標本固定
1.取材 對于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮，為了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要盡快固定或冷凍保存。
2.固定 進行原位雜交的組織或細胞必須經過固定處理，固定的目的是為了①保持細胞形態原有結構；②最大限度保存細胞內的DNA或RNA的水平；③使探針易于進入細胞或組織內。
3.固定液 常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。這些固定液都有不同的優缺點因此要根據具體的實驗對象，選擇最佳的固定液。
4.固定方法 組織標本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材組織大小為>1cm×0.5cm，不宜太大。必要時，動物組織可進行灌流固定，然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中，4℃過夜，次日可行冰凍切片。
(二)切片及細胞標本的制備
1.載玻片的處理 因為原位雜交一般在載玻片上進行，所以載玻片必須保持清潔且不能有任何核酸酶的污染。一般載玻片可先經洗衣粉浸泡過夜，用流水沖洗、酸中浸泡4～8h，再用流水沖洗，雙蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可經15磅高壓滅菌20min處理，可將載玻片上的核酸酶消除。
2.組織切片與預處理
（1）冰凍切片：新鮮組織也可在取材后，直接置入液氮中迅速驟冷，冷凍切片后，4％多聚甲醛固定5～10min，也可保存在-70℃中待用。雜交前切片迅速恢復至室溫并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10min，滴加預雜交液室溫孵育1h。
（2）石蠟切片：組織固定后，常規石蠟包埋切片，可長期保存，隨時用于原位雜交。雜交前切片經①二甲苯脫蠟2次，每次10min；②純酒精洗2次，每次5min；③空氣干燥5min；④梯度酒精復洗95％，80％，70％各1min；⑤0.1
mol PBS洗3次，每次5min；⑥2×SSC洗10min；⑦滴加預雜交液于濕盒內室溫孵育1h。
（3）培養細胞：每張載玻片滴加200μl濃度為1×105/m1的細胞懸浮液，空氣干燥1～2min制成細胞涂片，也可直接用培養細胞蓋片。上述細胞片經酒精或多聚甲醛固定5min，其余步驟同冰凍切片。