(三)試劑配制
配制溶液過程中均需戴手套，液體配制均用超凈水，所用瓶子均經160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。
1.DEPC水 將DEPC按1‰濃度加入超凈水中，充分混合后靜置過夜，15~20min高壓消毒，之后室溫避塵存放。
2.0.1mol PBS pH 7.4
A液：0.1mol NaH2PO4為NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O)1.56g；DEPC水100.00m1。
B液：0.1mol Na2HP04為Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其濃度達0.85％。
3.20×SSC 為NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L)4.410g；DEPC水50.00m1。
4.4％多聚甲醛(pH 7.4) 為多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。
5.緩沖液
（1） 緩沖液Ⅰ(pH 7.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超凈水加至1000ml。
（2） 緩沖液Ⅱ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。
（3） 緩沖液 Ⅲ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。
6.去離子甲酰胺 將陰陽離子交換樹脂各5g加入50ml甲酰胺中，待樹脂下沉后用上清液。
7.50％硫酸葡聚糖 5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不斷攪動使之完全溶解。
8.50×Denhardt's液 為1％Fico11type 400（聚蔗糖） 0.2g；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清白蛋白）0.2g；DEPC水 20.0ml。
9.預雜交液 為去離子甲酰胺5.0m1；20×SSC2.0m1；鮭魚精DNA (10mg/m1)
；0.5ml（沸水變性10min）；酵母tRNA (10mg/m1) 0.25m1；50％硫酸葡聚糖
2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。
(四)雜交與顯色
1．雜交 將已標記的探針加入預雜交液即成為雜交液（探針濃度為1μg/m1），切片經2×SSC短暫浸洗后，滴加雜交液，于濕盒內置37℃或<42℃孵育過夜。然后依次經2×SSC室溫浸洗1h，l×SSC室溫浸洗lh，0.5×SSC
37℃浸洗30min，0.5×SSC室溫浸洗30min。注意滴加雜交液時切片勿干燥。
2.顯色 以下各步均在室溫下進行。
（1）緩沖液I洗1min。
（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的緩沖液I孵育切片30min。
（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的緩沖液I稀釋羊抗Dig抗體。
（4）將抗體稀釋液滴加在切片上，封口膜覆蓋，濕盒內4℃孵育過夜。
（5）緩沖液I洗10min。
（6）緩沖液Ⅱ洗10min。
（7）加顯色液，封口膜覆蓋，避光室溫孵育2～20h，隨時鏡檢，當顯色滿意時入緩沖液Ⅲ終止顯色。
顯色液臨用前配，其配方為：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑 2.4mg；④ 緩沖液Ⅱ 加至10ml。
（8）常規脫水、透明、封固。
結果：雜交陽性信號為紫藍色顆粒。
(五)原位雜交對照試驗
同免疫組織化學染色對照一樣，為證明原位雜交實驗操作的準確性和實驗結果的特異性，需要設置一系列對照實驗，具體的各種對照實驗的設置及其意義請參考原位雜交專著，以下僅介紹幾種常用的對照實驗。
1.省去標記探針 在做原位雜交時，以PBS或預雜交液替代雜交液，結果應為陰性，這是一種簡便而有意義的陰性對照實驗。如省去標記探針仍出現陽性反應，這一定是假陽性。
2.自身對照 用同一組織切片或涂片上與靶序列無關的其他結構作對照。陽性與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。
3.陰性對照 用已知不存在相應靶序列的組織標本雜交，結果應為陰性。陰性對照可排除在雜交過程中由于非特異性雜交反應等因素造成的假陽性結果。
4.陽性對照 用已知含靶序列的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陽性，稱陽性對照。通過陽性對照可證明雜交過程中各個步驟以及所使用的試劑都合乎標準，實驗方法可靠。尤其當待檢標本為陰性時，陽性對照片呈陽性反應可排除待檢標本假陰性的可能。故若預期雜交結果為陰性時，就必須設陽性對照，當陽性對照亦不顯色，就證明雜交過程的某一步驟或所用試劑問題。