核酸提取技術簡史

發布時間：2021-07-01 11:33 原文鏈接：核酸提取技術簡史

核酸提取被用于許多分子生物化學試驗和診斷，是克隆、轉化、酶切、體外轉錄、擴增、測序等試驗的第一個步驟。然而由于細胞內存在大量蛋白質、碳水化合物、原始樣品中的代謝物以及其它污染物，提取高質量的核酸并非易事。現階段的層析柱核酸提取方法有：

（重要東西一般都放在前邊的，所以先介紹最新的技術，我們精耐特基因的殺手锏！！！）

1、一種新的層析柱技術-雙層柱技術

時間：2012年

人物：美國科學家丁少峰教授和劉強教授

事件：

發明了一種新的層析柱技術-雙層柱技術，以及基于該新雙層柱的核酸提取方法，用來克服常用的基于硅膠提取和基于陰離子交換提取核酸兩者的缺點，使核酸提取方法更加簡單、快速、高效、可靠，特別是在血漿和尿液的液體活檢中具有非常重要的應用價值^13-14。

結構：

雙層柱由2種膜組成：第一層為陰離子交換膜二乙胺（DEAE），第二層為二氧化硅膜 (Fig.1)。

原理：

（1）樣品中的核酸結合到第一層陰離子交換膜上，起核酸濃縮器的作用，

（2）已結合的核酸從第一層膜洗脫, 然后結合到第二層二氧化硅膜, 這是因為采用了雙功能洗脫/結合液, 也稱為耦聯液，

（3）最終使用低鹽緩沖液將游離核酸從第二層膜洗脫，獲得目的產物 (Fig.2)。

優點:

（1）特別適用于分離和純化含有極度稀釋的大容量的核酸樣品，例如10mL血漿或50mL尿液；

（2）游離的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常規硅膠提取法高出4倍, 適用于血漿及尿液游離核酸的提取；

（3）不需要蛋白酶處理；

（4）提供更高純度和更少抑制劑的核酸樣品；

（5）洗脫的核酸可直接用于下游應用, 包括焦磷酸化激活的聚合反應（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization，PAP）和聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、及二代測序等；

（6）此外，本方法快速、簡便，無需接觸苯酚及氯仿等毒性強烈的有機溶劑，無需復雜繁瑣的實驗操作，操作全程可在短時間內完成。

以下為常用的兩種方法。

2、硅膠為基礎的提取方法

時間：1979年

人物：美國科學家Vogelstein教授和 Gillespie教授

事件：發表了一項以硅膠或二氧化硅為基礎的提取方法¹。

材料：

微孔玻璃，嵌入二氧化硅顆粒的濾膜，硅膠顆粒，二氧化硅構成的藻土型樹脂，和玻璃纖維

步驟：

（1）在高濃度離液鹽的存在下，DNA或RNA會粘結到硅膠樹脂或膜的表面，其它污染被沖洗走，

（2）然后用水或低鹽緩沖液洗脫DNA或RNA，現在已成為一種流行的核酸提取方法^1-6。

原理：

（1）在高濃度的離液鹽，例如碘化鈉（NaI），高氯酸鈉（NaCIO4），鹽酸胍（GuHCl）, 和異硫氰酸胍（GuTC）等的條件下，帶負電荷的DNA 骨架與帶正電的硅膠表面具有高度的親和力。

（2）現階段已對離子強度、溫度、pH值、DNA大小和構象與核酸結合到硅膠表面上的影響進行了研究，例如，硅膠表面的結合能力與離液鹽濃度是呈線性相關的。在一個給定的離液鹽濃度下，pH值越低則所有類型的DNA與硅膠表面的結合能力越高⁷。

（3）常用的將核酸與硅膠表面粘結的試劑：異硫氰酸胍（GuTC）、鹽酸胍（GuHCl）、碘化鈉（NaI）、高氯酸鈉（NaCIO4）。條件控制為：在乙醇或異丙醇的條件下, 以及控制結合試劑PH值為6至7.5條件下，其結合效率顯著改善。

應用：

這種層析柱常用硅膠樹脂或膜作為固定相，并常用離心或真空來驅動,例如：

Promega公司的PureYield質粒小量提取系統

WizardPlus小量DNA制備純化系統

Qiagen 公司的QIAprep小量制備試劑盒

Bioland公司的EZgene質粒小量制備純化試劑盒

優點：

快速、簡便、有效、所純化的DNA質量高并可以用于多種下游應用

缺點：

高達3倍體積的離液鹽溶液被添加到1份體積的DNA或RNA樣品中方可達到硅膠結合DNA所需的有效離液鹽的濃度，因而血漿和尿液液體活檢標本的起始體積受到很大限制。

3、陰離子交換為基礎的提取方法

步驟：

在低pH值及低鹽濃度下，DNA可與陰離子交換劑結合，隨即可用高pH值及高濃度的鹽溶液來洗脫DNA^8-11。

原理：

是基于DNA主鏈上的帶負電荷的磷酸根離子與分子表面上帶正電的DEAE等基團之間的相互作用，溶液中的鹽濃度和pH值決定了是否結合或脫DNA。

應用：

（1）通常以微珠為基礎的陰離子交換柱多是重力流動型的，例如QIAGEN公司的基因組柱試劑盒，QIAGEN公司的樹脂由有一層二乙基氨基乙醇（DEAE）官能團的涂層；PALL公司的AcroSep層析柱，它是由弱的陰離子交換樹脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q強陰離子交換陶瓷HYPERD F微珠組成的。

（2）與基于微珠柱子相比，通常使用的為離心型或真空抽吸驅動型陰離子交換膜式柱子，例如Vivapure弱陰離子交換微型D膜離心柱、Vivapure強陰離子交換Q膜離心柱，它們具有流速高、成本低、高通量的優勢¹²。

優點：

簡單、安全、可靠，

其所制備的核酸具有相當于兩次CsCl梯度離心純化的超純度。

缺點：

因為在洗脫液中含有高濃度的鹽，洗脫的核酸是不能直接使用的，通常需要一個額外的步驟，例如，乙醇或異丙醇沉淀以去除鹽。

綜上所述，雙層柱提取技術無論是在對樣本的處理、實驗的操作及獲得產物的質量上，都是優于其他兩種方法的！

參考資料：

1. Vogelstein, B., and Gillespie, D. (1979). Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76, 615-619.

2. Chen, C.W., and Thomas, C.A., Jr. (1980). Recovery of DNA segments from agarose gels. Analytical biochemistry 101, 339-341.

3. Marko, M.A., Chipperfield, R., and Birnboim, H.C. (1982). A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. Analytical biochemistry 121, 382-387.

4. Boom, R., Sol, C.J., Salimans, M.M., Jansen, C.L., Wertheim-van Dillen, P.M., and van der Noordaa, J. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology 28, 495-503.

5. Boom, R., Sol, C., Beld, M., Weel, J., Goudsmit, J., and Wertheim-van Dillen, P. (1999). Improved silica-guanidiniumthiocyanate DNA isolation procedure based on selective binding of bovine alpha-casein to silica particles. Journal of clinical microbiology 37, 615-619.

6. Thompson, J.D., Cuddy, K.K., Haines, D.S., and Gillepsie, D. (1990). Extraction of cellular DNA from crude cell lysate with glass. Nucleic acids research 18, 1074.

7. Melzak, K.A.S., C.S. Turner, R.F.B. Haynes, C.A. (1996). Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J Colloid and Interface Science 181, 635–644.

8. Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing: Principles and Methods, GE Healthcare. http://wwwgelifesciencescom/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314823637792/litdoc11000421AB_20110901010317pdf.

9. Teeters, M.A., Conrardy, S.E., Thomas, B.L., Root, T.W., and Lightfoot, E.N. (2003). Adsorptive membrane chromatography for purification of plasmid DNA. Journal of chromatography A 989, 165-173.

10. Endres, H.N., Johnson, J.A., Ross, C.A., Welp, J.K., and Etzel, M.R. (2003). Evaluation of an ion-exchange membrane for the purification of plasmid DNA. Biotechnology and applied biochemistry 37, 259-266.

11. Zhang, S., Krivosheyeva, A., and Nochumson, S. (2003). Large-scale capture and partial purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules. Biotechnology and applied biochemistry 37, 245-249.

12. Ashby, M.K.M., C.W. Rapid Purification of High Molecular Weight Bacterial Chromosomal DNA using the Vivapure 500 and Vivapure 20-D anion exchange membrane devices. Vivascience application note http://sartoriusorkr/Vivascience/Application_Notes/pdf/ASH_IE_0124pdf.

13. Ding, S.F. and Liu, Q. (2015). Chromatography column and method for isolating nucleic acid. US patent 9,163,230.

14. 丁少峰、劉強 (2016). 一種層析柱及核酸提取方法. 中國發明ZL 2013100980999。