核酸提取和純化控制程序
1. 目的：規定DNA和RNA核酸樣本提取和純化實驗應遵守的操作。
2. 適用范圍：生物樣本提取DNA和RNA核酸，并包括對核酸樣品的長期保存。
3. 基本定義和術語：
DNA，脫氧核糖核：基因組DNA構成了生物體的完整遺傳信息。幾乎所有生物體的基因組組成都是DNA，僅有的例外是具有RNA基因組的部分病毒。不同生物體的染色體的尺寸、數量，以及基因組DNA的性質各異。病毒DNA基因組相對較小，可以為單鏈或雙鏈，線狀或循環狀。所有其它生物體的基因組都是雙鏈DNA形式。細菌具有單個循環狀的染色體。在真核生物體內，多數基因組DNA位于細胞核內（核內DNA），構成多條不同尺寸的線狀染色體。此外，在真核細胞的線粒體內，以及植物和低等真核生物的葉綠體內，也額外含有基因組DNA。這一類DNA通常為環狀分子，以這些細胞器內的多拷貝形式存在。質粒DNA為細菌內雙鏈閉合環狀DNA分子，大小為1 kb 到大于200 kb不等。質粒中通常含有編碼（在部分環境下）有利于宿主細胞的酶的基因。這些編碼的酶可能會參與抵制環境內檢出的毒素（例如，復雜的有機復合物）或者細菌自身產生的毒素，或生成相應的抗體。質粒DNA純化后，可用于測序、PCR、蛋白表達、轉染以及基因療法等一系列下游應用。
RNA，核糖核酸：RNA是具有多種不同的功能的生物大分子。信使RNA（mRNA）是DNA轉錄得到的，用做蛋白質合成的模板。蛋白質的合成是由核糖體完成的，核糖體由核糖體RNA（rRNA）和蛋白質組成。非編碼RNA也是非常重要的，它們通常在基因表達的調控中發揮作用。一個典型的快速生長的哺乳動物細胞培養中,每個細胞大約含有10–30 pg的RNA，而一個完全分化的原代細胞中，RNA的量要少得多——大約每個細胞中RNA的含量小于1 pg。細胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大約占細胞中RNA總量的1–5%，但是具體的量取決于細胞類型和細胞的生理狀態。一個動物細胞中，大約有360,000個mRNA分子，組成了大約12,000個轉錄本，一個典型轉錄本的長度大約為2 kb。一些mRNA分子占到了總mRNA的3%，而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。這些“稀有的”或者“低豐度”的mRNA分子在每個細胞中只有5–15個拷貝。但是，這些稀有的mRNA大約有11,000種，占到了mRNA數量的45%。一個生物體中的基因是相對固定的，因此，mRNA的組成代表了在給定的條件下，基因的表達方式。使用雜交技術，包括RNA印跡法（northern印跡）和微陣列分析，或RT-PCR技術、轉錄本測序技術（RNA-seq）對RNA進行分析，能夠充分反映一個生物體中的基因表達譜。
4. 設備和器材：低溫冰箱，烤箱，高速冷凍離心機，各種規格的加樣器，DNase與RNase free的pipet頭、1.5ml和2ml離心管，研砵、研棒，金屬藥勺，金屬鑷子等。
5. 正文
①
實驗室設置：實驗室內各操作區域應相對獨立，設備物品如加樣器應盡可能專用。
②
DNA提取處理規范：DNA是一種相對穩定的分子。但應避免在DNA溶液中引入核酸酶，因為此類酶會造成DNA降解。基因組DNA由超大的DNA分子構成，因此較為脆弱，極易被破壞。為確保基因組DNA的完整性，應避免進行過多和過于粗糙的移液和渦旋振蕩操作。DNA儲存在水中時，極易酸性水解，長期儲存時建議將其儲存在TE緩沖液中。
③
RNA提取處理規范：處理RNA時，一定要使用合適的微生物學的無菌技術。手和灰塵顆粒可能會攜帶細菌和霉菌，是最常見的核糖核酸酶污染源。為了阻止來源于皮膚表面或者實驗室器械灰塵上的核糖核酸酶污染，在操縱試劑以及RNA樣品的時候，一直要佩戴乳膠手套或者乙烯基手套（PVC手套）。可能的情況下，要經常更換手套，并將試管處于關閉狀態。當用移液管吸取溶液用于下游應用時，要將純化過的RNA放在冰上。可以高溫烘烤的設備250℃干烤8h以上；不宜高溫烘烤的材料，0.1%DEPC浸泡后高壓處理。關鍵操作步驟推薦在超凈工作臺內進行，佩戴一次性手套與口罩。
6. 質量控制
DNA質量控制
可采用分光光度法（Nanodrop）測定DNA濃度和質量
DNA和RNA的濃度應通過分光光度計測定260 nm (A260)下的吸光度來測定。出于準確度需要，260 nm下的吸光度讀數應將至0.15到1.0之間。在10 mM Tris?Cl、pH 8.5條件下，純凈的DNA的A260/A280比率約等于1.8。
A260/A280 大于1.9表示有RNA污染。
A260/A280 小于1.6表示有蛋白質等污染物存在。
在270 nm和275 nm處的強吸光度則表示存在污染物苯酚。
在325 nm處的吸光度表示很可能存在溶液或臟污的器皿造成的污染。
RNA質量控制
分光光度計檢測RNA的濃度和質量（推薦使用Nanodrop）
在260 nm與280 nm讀值之間的比例（A260/A280）能夠反映RNA的純度，因為如蛋白一類的污染物會吸收紫外光。不過，A260/A280的比值也受到pH值的顯著影響。當使用沒有緩沖能力的水時，pH值與A260/A280的比值結果都會發生大范圍的改變。較低的pH值會導致A260/A280的比值變小，對蛋白質污染的敏感性也會隨之降低。
純RNA的A260/A280 比率約為1.8–2.1。
比值低于1.7說明有蛋白質或酚類污染。
RNA的完整度檢測
總RNA的完整度和大小分布可以通過變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統（如QIAxcel系統或Agilent 2100 ）進行檢測。每條核糖體RNA的富集區域在凝膠染色之后應顯現為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利，卻出現小尺寸RNA的彌散情況，則很可能因為RNA樣品在制備過程中發生了嚴重的降解。
Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠提供RNA完整數目（RNA Integrity Number，RIN）這一參數，作為對RNA完整度的一個有用量度。在理想情況下RIN值應接近10，不過在許多情況下（特別是對組織樣本來說），RNA品質主要取決于原始樣本的保存情況。
從RNA中去除基因組DNA污染
目前還沒有哪一種純化步驟能保證RNA中不含DNA，即使在瓊脂糖凝膠電泳上檢測不到DNA。對于低豐度目標序列的研究，殘留的DNA污染物對樣品的任何干擾，都能夠通過real-time RT-PCR 對照實驗檢測到，在這些對照實驗中，PCR反應之前不加入逆轉錄酶。為了避免real-time RT-PCR 實驗中DNA的干擾，推薦設計與內含子的剪接位點相結合的引物，這樣就避免了基因組DNA的擴增。也可以使用一些商業化的試劑盒，在cDNA合成時，去除基因組DNA。
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