核酸酶保護實驗

核酸酶

ATP CTP GTP MUTP EDTA NaCl 甲酰胺 Tris-HCl RNase A RNase T1 RNasin DTT UTP T7RNA聚合酶 DNaseⅠ 飽和酚 氯仿 酵母tRNA NaAc 無水乙醇 SDS 蛋白酶K 異丙醇 丙烯酰胺 亞甲雙丙烯酰胺 TBE 尿素 過硫酸胺 TEMED

低溫離心機 恒溫培養箱 恒溫水浴鍋 電泳儀 保鮮膜

1.  在一個高壓過的微量離心管中建立20 μl 的反應復合物如下：

（1）4 μl  5×轉錄緩沖液

（2）1 μl  200 mmol/的3NTP混合液

（3）10 μl  ［α-³²P］CTP

（4）1 μl  胎盤核酸酶抑制劑

（5）1 μl  1 mg/ml 模板DNA

（6）1 μl  噬菌體RNA聚合酶

（7）SP6 RNA聚合酶反應時在40℃保溫30~60 min。采用T7或T3 RNA聚合酶則在37℃溫育。

2.  加人5 μg 或10 U 無RNA酶的酶 I，37℃溫育15 min。

3.  加入2 μl 10 mg/ml 的tRNA，補水至50 μl，以酚/氯仿/異戊酵抽提。

4.  水相加入200 μl，2.5 mol/l 乙酸銨和750 μl 無水乙醇，混勻后在冰浴飯置15 min，于4℃在微量離心機中離心15 min。

5.  重溶于50 μl 水，按第4步操作所述重新沉淀兩次，最后得到的沉淀以75%乙醇/25% 0.1 mol/l pH5.2的乙酸鈉緩沖液洗滌，晾干沉淀并溶解于100 μl 雜交液，取1 μl 計數。

6.  RNA以乙醇沉淀，并溶解于30 μl 含5×10⁵ cpm RNA探針的雜交液中，于85℃加熱變性5 min，移至設定的雜交溫度（30~60℃），溫育8 h 以上。

7.  加入350 μl 含40 μg/ml 的核酸酶A和2 μg/ml 核酸酶T1的核酸酶消化緩沖液，于30℃溫育30~60 min。

8.  加入10 μl 20%SDS和2.5 μl 20 μg/ml 的蛋白酶K，37℃溫育30~60 min。

9.  用400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，水相移入含1 μl 10 mg/ml tRNA的離心管中，加入1 ml 乙醇沉淀，晾干后溶解于3~5 μl RNA加樣緩沖液中。

10.  于85℃加熱變性3 min，在變性的聚丙烯酰胺/尿素凝膠（序列膠）中電泳，用增感屏放射自顯影過夜，分析結果。