根據引物合成單如何設定PCR退火溫度？

• PCR退火溫度應如何設置？

問題：引物單上數據如下

上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)

Tm(1M Na+)：68.2

Tm(50mM Na+)：46.6

下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)

Tm(1M Na+)：66.2

Tm(50mM Na+)：44.6

順便問下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么區別啊?

回答：

TM值是在一定buffer鹽濃度情況下計算出來的。你需要查一下你的PCR體系里buffer鹽的濃度，然后找相應的TM值。不過TM值也是一個估算值，舉個例子，以你的正向引物而說，TTACAAGATGGAGCCTCACC。在primer5計算得到TM是54.0， DNASTAR是49.1.所以這個數值僅供參考，最穩妥的做法是用梯度PCR儀  從55-65做一個梯度PCR。

PCR能不能做出來最關鍵的因素有兩個，第一，模板質量如何，第二，引物3'是否有錯配，gc含量如何。如果錯配不嚴重的話，采用無腦梯度pcr的方法總能找到一個合適的退火溫度  。