根據結構信息確定殘基的突變是鑒定新蛋白質分子中突變殘基最有效最直接的方法。可利用X射線或NMR進行新蛋白質分子的三維結構測定，這種方法可以直接提供突變蛋白的高分辨率結構及評估結構整體性。根據新測定的三維結構與突變前的三維結構進行分析比較。重點分析突變位點的氨基酸殘基在三維結構中的位置，以及與其他基團之間形成的氫鍵、離子對或疏水相互作用等，以證實該位點殘基在蛋白質分子的結構與功能中的作用。Alan Fersht和GregWinter等測定了酪氨酰一tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的絲氨酸所取代后的結構，發現Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3'羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。蛋白質三維結構的測定，可用于鑒定最暴露于蛋白質表面的殘基，還可用于估計專一性突變對結構改變的可能性。這種方法需要較大量的純的突變蛋白，并要花較長時間，因此這種技術不能用于常規的大量突變體的分析。