No.4靶向膜融合的廣譜抗病毒多肽研究
作為動物來源的病毒，冠狀病毒因其多樣性，較高的傳播能力和進化能力限制了單一的靶向療法的臨床應用。因此，從長遠角度來看，能作用于多種冠狀病毒的新型廣譜抗病毒藥物，會成為抗擊流行性和新型冠狀病毒感染的終極武器。相較于高度變異的受體結合區(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)區高度保守。同時膜融合也是病毒感染和復制重要的功能性過程。因此，該區域成為了抑制性多肽的研究重點。靶向冠狀病毒的膜融合過程，來自于復旦大學的研究團隊研發出廣譜多肽抑制劑EK1，為抗擊冠狀病毒和類似病毒提供了新的大分子治療策略[7]。
冠狀病毒可通過胞內體膜融合途徑(Endosomal pathway)或/和細胞表面胞漿膜融合途徑(Non-endosomal pathway)進入細胞。病毒通過結合宿主細胞受體激活其S2亞基的HR1和HR2區，互相結合形成對膜融合至關重要的6-HB(Six-helix bundle)結構。
冠狀病毒的膜融合過程和競爭性多肽工作機制，圖片源自參考資料7。
鑒于此，研究人員以多種冠狀病毒的保守HR區為模板，合成HR1和HR2區來源的多肽（HR1P和HR2P）用于競爭。通過過表達技術，研究進一步建立靶向多種冠狀病毒的細胞細胞融合實驗，系統性篩查HR1P和HR2P對細胞融合的抑制。結果顯示由OC43株來源的HR2P具有廣譜且強效的抑制融合能力。在此基礎上，研究人員通過引入氨基酸和突變等方法，進一步優化多肽的可溶性和成藥性。所獲得的多肽EK1，在進一步的一系列體外檢測，包括細胞細胞融合實驗，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力檢測中，都表現出強效的廣譜抗病毒能力。
細胞細胞融合實驗，過表達病毒S蛋白并帶有GFP信號的293T細胞為作用細胞，Huh-7為靶細胞，圖片源自參考資料7。
除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽類藥物的另一優勢是支持非侵入性鼻腔給藥，適合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，檢測鼻腔給藥下的EK1的體內分布非常重要。基于活體成像技術，研究觀察到Cy5熒光標記的EK1可廣泛分布于整個呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝臟、腎和脾，都能檢測到EK1的分布，表明EK1可以進入血液循環系統和其他臟器中。因此，EK1還可能作用于由冠狀病毒導致的系統性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表現出強力的抗病毒能力，有效抑制了因感染帶來的體重減輕和死亡現象。從體外到體內的多方面安全性評價表明通過鼻腔給藥的EK1是低免疫原性，安全的治療策略。因此，EK1是一個新型、有潛力的廣譜抗冠狀病毒藥物，值得進一步的深入研究。
上：基于活體成像檢測鼻腔給藥下Cy5標記的EK1在小鼠體內的分布；小動物活體成像檢測基于IVIS平臺。下：EK1處理對模型鼠死亡率、體重和病毒滴度的影響，圖片源自參考資料7。
總結
通過上述四個案例，我們總體介紹了靶向病毒段的大分子療法的研究流程和關注點。助力此類治療方法的研發，珀金埃爾默提供成熟的整體應用解決方案。針對攜帶螢火蟲報告基因的假病毒研究，我們提供全面、配套的涵蓋化學發光試劑，微孔板和高通量檢測平臺的解決方案。對于基于慢病毒包裝系統的假病毒，我們還可以提供p24檢測解決方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平臺的解決方案，我們還可以分析短程和長程的復雜亞細胞活動，例如由病毒介導的膜融合過程。在血清和抗體的篩查和分析中，強大的高內涵解決方案能最大程度發揮表型篩選的優勢，發現具有中和能力、安全的潛在抗體。同時，ADCC，作為關鍵的抗感染抗體工作機制之一，也是我們的主要應用關注點。針對ADCC的檢測，我們提供金標準、靈活的放射和非放射解決方案，助力抗體類藥物的深入評價[8]。最后，在臨床前動物研究中，除了中和檢測外，我們提供覆蓋功能到結構的活體成像解決方案，助力病理檢測、藥物分析和藥效評價等核心工作。
參考文獻
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