No.2基于轉基因牛的抗病毒血清研究
在抗擊SARS和流感的臨床療法中，“恢復期血漿”治療(Convalescent?phase plasma therapy)獲得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，該法的療效很大程度上依賴于是否能及時獲得有效的血清。相比下，基于動物的超免疫血清雖然能解決量的問題，但其使用可能會導致嚴重的免疫反應和毒性。單克隆抗體療法，又一種基于被動免疫的治療方法，面臨耗時長和出現耐藥突變病毒株等挑戰。
為了解決上述的問題，有研究人員將目光轉向了轉基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)來快速獲得大量、有效的抗病毒血清。通過基因工程，研究人員敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可指定IgG亞型人抗體表達體系，來達到免疫系統人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高達150到600 g的人IgG。目前，已有多項臨床前研究利用該技術對抗MERS和Ebola等傳染病[3,4]。在此，我們著重介紹靶向MERS的研究。
在免疫原段，該研究利用了兩種材料：滅活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的納米材料(SPNV)。兩種免疫原均能刺激產生S蛋白特異的血清和人IgG(SAB-300/301)。基于安全性和生產可行性等因素，研究主要圍繞基于SPNV產生的人IgG開展動物和臨床研究。
上圖：基于轉基因牛的免疫過程。下圖：利用Anti-Spike抗體檢測所得血清（左）和純化人IgG（右）的有效含量。圖片源自參考資料3。
除了特異性檢測外，研究利用免疫熒光成像技術，結合Anti-Spike抗體來衡量免疫所得血清和抗體的抗病毒中和作用(FRNA50)。相較于只能完成一輪感染的假病毒體系，FRNA50能直觀、全面地反映藥物處理對于病毒感染能力的影響。在該研究中，此法還結合mRNA檢測驗證病毒的滅活效果，確保疫苗的安全性。結合FRNA50和傳統的半數組織培養感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)測定法，研究證明純化的血清含有高水平的中和多抗。在過表達DPP4的小鼠模型上，無論是預防性還是治療性給藥，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗體依賴的病毒感染增強作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已進入一期臨床試驗。
利用FRNA50檢測所得血清（左）和純化人IgG（右）靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高內涵平臺和配套微孔板。圖片源自參考資料3。
No.3利用ADCC抗擊H7N9禽流感的單抗研究
作為腫瘤免疫療法的主要推動者，單克隆抗體（單抗）也被廣泛用于抗擊SARS和HIV等多種病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和單抗的研究也為疫苗設計提供了新的思路。但是，基于雜交瘤技術的傳統單抗制備面臨著耗時長，步驟多且繁瑣等問題，限制了其對可能出現的新型疫情爆發的應對能力。相比下，噬菌體展示技術為快讀獲得高親和力人源單抗提供了新的途徑。基于該技術平臺，復旦大學研究人員建立超大型天然全人源抗體庫，并成功鑒定靶向MERS和流感的強力抗體[5,6]。
在抗擊H7N9流感的工作中，為了獲得低突變的高特異抗體，研究人員以重組表達的HA和HA1蛋白為抗原，基于健康人B細胞來源的天然抗體庫開展多輪篩選，獲得單抗m826。經序列分析，研究人員證明m826與胚系基因高度同源，是胚系抗體。相較于體細胞高度突變的抗體，胚系抗體建立時間短，安全性高且成藥性更好，適用于靶向急性感染的抗體和疫苗研發。
基于噬菌體展示技術的H7N9抗體篩選，圖片源自參考資料6。
非常有意思的是，在紅細胞凝集抑制 (Hemagglutination inhibition,HI)反應中，m826僅表現出微弱的抗病毒能力。進一步的細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)檢測和免疫熒光法中和實驗證明m826不能中和流感病毒，抑制其在靶細胞的增殖。利用親脂性熒光染料R18和SP-DiOC18（3）來標記病毒，研究發現m826對病毒與靶細胞的結合和膜融合過程無顯著影響。但是，m826能很強結合表達H7N9 HA蛋白的細胞，是ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用）活力的強力介導者。同時，由于不能中和H7N9病毒，m826還能成為高價值的工具性抗體。在動物模型上，IgG1 m826能有效的預防和控制H7N9的感染。因此，m826依賴于ADCC，而不是中和能力抗擊流感病毒。這一發現為抗病毒抗體的篩選和研發提供了新的思路和途徑。
左圖：基于免疫熒光成像技術（熒光標記病毒）的中和實驗，H7N4抗體為中和陽性對照。右上：病毒結合檢測，紅色熒光探針R18標記病毒，感染30分鐘后進行成像檢測。NA為結合陰性對照；m336為陰性對照抗體。右下：利用熒光探針R18和SP-DiOC18（3）雙標記病毒，病毒膜融合發生會誘導SP-DiOC18（3）綠色熒光信號加強。Baf A1為融合陰性對照。上述高通量成像檢測均基于Opera或Operetta高內涵平臺。圖片源自參考資料6。