植物體內可溶性蛋白質含量的測定:考馬斯亮藍G250染色法

【原理】

考馬斯亮藍G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G－250在游離狀態下呈紅色，在稀酸溶液中，當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白質濃度范圍內(1～100μg)，蛋白質與色素結合物在595nM波長下的光吸收與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G－250結合在2Min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1H內保持穩定。該反應快速靈敏(靈敏度比ＦolIn－酚法還高4倍)、易于操作、干擾物質少(考馬斯亮藍G－250和蛋白質通過范德華力結合，受蛋白質的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質染色強度差異不大)，可測定微克級蛋白質含量，是一種比較好的蛋白質定量法。但此方法也存在其缺點，考馬斯亮藍在蛋白質含量很高時線性關系偏低，且不同來源蛋白質與色素結合狀況有差異。

【儀器與用具】

721分光光度計  ；10Ml量筒1個；研缽；燒杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，01Ml 3支；10Ml具塞刻度試管14支。

【試劑】

標準蛋白質溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白質100μg／Ml的標準蛋白溶液;

90％乙醇；

85％磷酸(W／V)；

考馬斯亮藍G－250溶液：稱取100μg考馬斯亮藍G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸餾水定容到1000Ml，貯放在棕色瓶中，此溶液在常溫下可放置1個月。

【方法】

1標準曲線(蛋白質含量為0～100μg／Ml)的繪制　取6支具塞試管，按表2－1數據配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白  質液各1Ml。

表2－1不同蛋白質含量的牛血清蛋白質液配制表

管號123456蛋白質標準液（ml)00.200.400.600.801.00蒸餾水（ml)1.000.800.600.400.200蛋白質含量（μg）020406080100在每支試管中加入5Ml考馬斯亮藍G－250溶液，蓋塞，反轉混合數次，放置2Min后，用1CM光徑比色杯在595nM下比色。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

2.樣品提取液中蛋白質濃度的測定　吸取樣品提取液1.0Ml(樣品提取見LoWry法)，放入具塞試管中(每個樣品設置兩個重復)，加入5Ml考馬斯亮藍G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，記錄吸光值，并通過標準曲線查得蛋白質含量。

3結果計算

樣品中蛋白質的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000（2-2）

式中C：查標準曲線值(μg)；VT：提取液總體積(Ml)；

ＦW：樣品鮮重(g)； V1：測定時加樣量(Ml)。