實驗方法原理
| 在生物體中，氧作為電子傳遞的受體，得到單電子時，生成超氧陰離子自由基（O2－）。 利用羥胺氧化的方法可以測定生物系統中O2－含量。O2－與羥胺反應生成NO2－，NO2－在對氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉紅色的偶氮染料（對－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波長處測定吸光度（A）值，根據A530值可以算出樣品中O2－含量。反應式如下： | |
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、材料儀器設備及試劑 1. 材料：花生、綠豆、大豆黃化幼苗的下胚軸及其他植物葉片。 2. 儀器設備：高速冷凍離心機，分光光度計，恒溫水浴鍋，研缽，試管，移液管，試管架，移液管架，洗耳球等。 3. 試劑配制： 50 mmol·L－1磷酸緩沖液（pH7.8） 1 mmol·L－1鹽酸羥胺 17 mmol·L－1對氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制） 7 mmol·L－1 α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制） 50nmol· ml－1NaNO2母液 二、實驗步驟 1. 提取液制備 稱取1g植物葉片放入冰浴的研缽中，加入50mmol·L－1磷酸緩沖液（pH7.8）5 ml, 研磨成勻漿，在1000r/min，4℃下離心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下離心20min，第二次上清液即為樣品提取液。 2. 亞硝酸根標準曲線的制作 2.1系列濃度NaNO2溶液的配制 取50nmol· ml－1NaNO2母液，分別稀釋成0、10、20、30、40和50、nmol· ml－1的標準稀釋液。 2.2取7支試管，編0～6號，分別加10、15、20、30、40、50、nmol· ml－1NaNO2標準稀釋液1 ml，0號管加蒸餾水1 ml，然后各管再加50mmol·L－1磷酸緩沖液1 ml，17 mmol·L－1對氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1 α－萘胺1 ml，置于25℃顯色20min后，以0號管作空白對照，在530nm波長處測定吸光度（A）值。 2.3 標準曲線繪制 以1～6號管亞硝酸根（NO2－）濃度為橫坐標，吸光度值作縱坐標，繪制標準曲線。 3. O2－含量測定 取4支試管，編0～3號，1～號管分別加入樣品提取液0.5 ml（三個重復），0號管加蒸餾水0.5 ml，然后各管加入50mmol·L－1磷酸緩沖液0.5 ml，1 mmol·L－1鹽酸羥胺1 ml，混勻，置于25℃ 1 h后，各管再加入17 mmol·L－1對氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1α－萘胺1 ml，混勻，置于25℃顯色20min，以0號管為空白對照，在530nm波長處測定吸光度（A）值。 三、結果計算 根據所測得的A530值，從標準曲線上查得樣品中NO2－濃度，按公式（1）即可計算出樣品中NO2－濃度。然后依據羥胺與O2－的上述反應，從NO2－對O2－進行化學計量，按公式（2）計算，即將按公式（1）計算得到的NO2－濃度乘2，得O2－濃度。也可根據被測樣品與羥胺反應的時間和樣品中蛋白質含量，按公式（3）求得O2－的生產率。  |
| 注意事項 | 如果樣品中含有大量葉綠素將干擾測定，可在樣品液與羥胺溫浴后，加入等體積乙醚提取葉綠素。 |
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