植物體內游離脯氨酸含量的測定

實驗概要

掌握小麥葉片內游離脯氨酸含量的測定方法。

實驗原理

植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時，游離脯氨酸便會大量積累，并且積累指數與植物的抗逆性有關。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標。

脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很強的水合能力，其水溶液具有很高的水勢。脯氨酸的  疏水端可和蛋白質結合，親水端可與水分子結合，蛋白質可借助脯氨酸束縛更多的水，從而防止 滲透脅迫條件下蛋白質的脫水變性。  因此脯氨酸在植物的滲透調節中起重要作用， 而且即使在含 水量很低的細胞內，脯氨酸溶液仍能提供足夠的自由水，以維持正常的生命活動。正常情況下，  植物體內脯氨酸含量并不高，但遭受水分、鹽分等脅迫時體內的脯氨酸含量往往增加，它在一定  程度上反映植物受環境水分和鹽度脅迫的情況，以及植物對水分和鹽分脅迫的忍耐及抵抗能力。

采用磺基水楊酸提取植物體內的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態（干或鮮樣）限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內與其消光度成正比。

主要試劑

3%磺基水楊酸水溶液
甲苯
2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作為溶劑進行配制，此液在4℃下2～3日有效
脯氨酸標準溶液：稱取25mg脯氨酸，蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100μg/ml。再取此液10ml用蒸餾水稀釋至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸標準液  

主要設備

分光光度計
水浴鍋
漏斗
20ml大試管數支
20ml具塞刻度試管9支
5～10ml注射器或滴管

實驗材料

小麥葉片

實驗步驟

1．標準曲線制作
表1  各試管中試劑加入量

  （1）取7支具塞刻度試管按表38-1加入各試劑。混勻后加玻璃球塞，在沸水中加熱40min。   （2）取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層以“0”管為對照在波長520nm下比色。   （3）以消光值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。
2．樣品測定   （1）脯氨酸提取  取不同處理的剪碎混勻小麥葉片0.2～0.5g（干樣根據水分含量酌減），分別置于大試管中，加入5ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。   （2）取出試管待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱40min，下一步操作按標準曲線制做方法進行甲苯萃取和比色。   （3）結果計算：從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度，按下式計算樣品中脯氨酸含量的百分數。
脯氨酸（μg/g FW或DW）= (C*(V/a)) / W
式中  C—提取液中脯氨酸濃度（μg），由標準曲線求得； V—提取液總體積（ml）； a—測定時所吸取的體積（ml）； W—樣品重（g）。
 

注意事項

質膜相對透性的測定雖簡單，但干擾因素多，測定時應注意以下問題：
1. 取材的一致性，代表性；
2. 器皿和用具要清潔；
3. 測試條件要一致，如測試溫度等要一致；
4. 注意不同材料其適宜的浸泡時間均不相同。