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  • 發布時間:2019-11-12 10:54 原文鏈接: 植物體內的轉氨基作用分析

    目的要求
    1. 掌握轉氨基作用的特點,了解轉氨酶的作用;
    2. 學習紙層析基本技術。

    原 理
    植物  體內通過轉氨酶的作用,α-氨基酸上氨基可轉移到α-酮酸原來酮基的位置上,結果形成一種新的α-酮酸和一種新的α-氨基酸,所生成的氨基酸可用紙上層析法檢出。

    試劑和器材
    一、試劑
    綠豆芽子葉及胚軸,0.1mol/L丙氨酸溶液,0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液(用NaOH中和至pH7),含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/L磷酸緩沖液  (pH8.0),磷酸緩沖液(pH7.5),正丁醇,甲酸,0.1mol/L谷氨酸溶液,0.1%~0.25%茚三酮丙酮溶液。
    二、器材
    研缽,10ml量筒,離心機  ,試管,移液管,恒溫箱,漏斗,層析缸,層析紙,毛細管,吹風機。

    操作方法
    一、酶液的提取
    取發芽2~3天的綠豆芽5g,放入研缽中,加2ml磷酸緩沖液(pH8.0)研磨成勻漿,轉入離心管。研缽再用該1ml緩沖溶液沖洗,并入離心管中,以3000r/min的轉速離心10min,取上清液備用。
    二、酶促反應
    取3支試管編號,按下表分別加入試劑和酶液(單位ml)
    將試管搖勻后置于37℃恒溫箱中保溫30min。取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液終止酶反應,于沸水浴中加熱10min,使蛋白質完全沉淀,冷卻后離心或過濾,取上清液或濾液備用。
    三、層析
    取層析紙一張,在距底線2cm處用鉛筆劃一水平線,在線上等距離確定5個點,作為點樣位置,相鄰各點間距2.5cm。取上述上清液或濾液及谷氨酸、丙氨酸標準液分別點樣,反應液點5~6滴,標準液點2滴。每點一次用吹風機吹干后再點下一次。最后沿垂直于基線的方向將濾紙卷成圓筒,以線縫合,注意紙邊不能疊在一起或接觸。
    在層析缸中放入正丁醇、甲酸、水推動劑的混合試劑(15:3:2)。待缸內蒸氣飽和后,將濾紙筒垂直放入,展層,待溶劑前沿上升至距濾紙前沿約2cm取出,用鉛筆標出前沿位置。吹干,剪斷縫線,以0.1%~0.25%茚三酮丙酮溶液噴霧,置烘箱(60℃)內或用吹風機烘干后顯色。

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