實驗概要
本實驗介紹了原生質體分離的方法及利用PEG原生質體融合的原理和方法。
實驗原理
植物原生質體是除去細胞壁后為原生質所包圍的“裸露細胞”，是開展基礎研究的理想材料。其中酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁，即可得到原生質體。由于原生質體內部與外界環境之間僅隔一層薄薄的細胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,還應當考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質體的影響。測定原生質體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質膜。一旦進入原生質體后,由于受到酯酶分解而產生具有熒光的極性物質熒光素。它不能自由出入原生質膜,因此有活力的細胞能產生熒光,無活力的原生質體不能分解FAD無熒光產生。許多化學、物理學和生物學方法可誘導原生質體融合，現在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高鈣高pH法和電融合法；聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，20～50％的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生質體融合得以完成。聚乙二醇（PEG）誘導如何的機理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚鍵而具有負極性，與水、蛋白質和碳水化合物等一些正極化基團能形成氫鍵，當聚乙二醇（PEG）分子足夠長時，可作為臨近原生質表面之間的分子橋而使之粘連、聚乙二醇（PEG）也能連接鈣等陽離子，鈣可在一些負極化基團和聚乙二醇（PEG）之間形成橋，因而促進粘連。從而引起原生質體融合：高鈣高pH由于增加了質膜的流動性，因而也大大提高了融合頻率，洗滌時滲透壓沖擊也可能起作用。原生質體分離純化后，在適當的培養基上應用合適的培養方法，能夠再生細胞壁，并啟動細胞持續分裂，直至形成細胞團，長成愈傷組織或胚狀體，再分化發育成苗。其中，選擇合適的培養基及培養方法時原生質體培養中最基礎也是最關鍵的環節。PEG為一種高分子化合物，能與水、蛋白質、和碳水化合物等一些基團能形成氫鍵。普遍認為聚乙二醇分子能改變各類細胞的膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發生融合。該方法的優點是：用法簡單，容易獲得融合體，融合效果好。
主要試劑
1. 20%蔗糖；
2. 13%CPW洗液：
27.2mg/L 磷酸二氫鉀（KH2PO4）
101.0mg/L 硝酸鉀（KNO3）
1480.0mg/L 兩個結晶水的氯化鈣（CaCl22H2O）
246.0mg/L 硫酸鎂（MgSO4）
0.16mg/L 碘化鉀（KI）
0.025mg/L 硫酸銅（CuSO4）
13%W/V 甘露醇
pH6.0
3. 酶液：
1% 纖維素酶
1% 果膠酶
0.7M 甘露醇
0.7mM 磷酸二氫鉀（KH2PO4）
10mM 兩個結晶水的氯化鈣（CaCl22H2O）
pH6.8-7.0
4. 40% PEG液：
40% PEG液（MW 1500-6000）
0.3M 葡萄糖
3.5mM 兩個結晶水的氯化鈣（CaCl22H2O）
0.7mM 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。
主要設備
350目網，離心機，試管，離心管，吸管，顯微鏡，恒溫水浴鍋。
實驗材料
1. 韭菜或大蒜葉；
2. 紅辣椒。
實驗步驟
植物原生質體的分離與純化：
1. 將撕去表皮的植物葉片或花瓣置于酶液（pH 6.9,去表皮面接觸酶液），在25℃黑暗條件下，酶解1～2小時。
2. 用350目網過濾除去未完全消化的葉片等殘渣。
3. 在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清液。 紅辣椒800轉/分離心5分鐘。加入3～4ml13%CPW洗液，相同條件下離心 ，棄上清液。加1ml13%CPW洗液懸浮。
4. 蔗糖漂浮法去除碎片。
蔗糖漂浮方法：
1）用細口吸管吸20%蔗糖溶液約3ml，小心插入盛有原生質體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質體懸液中間有一明顯界面(注意要有明顯界面).
2) 離心5分鐘（1000轉/分，辣椒800轉/分），此時死細胞及碎片降至蔗糖溶液內，聚集在離心管底部，而活細胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處，
3) 用細管吸取漂浮在上下界面處的健康原生質體，轉入干凈的離心管中，加入3～4ml13%CPW洗液離心（鏡檢決定是否需要離心），離心5分鐘（1000轉/分，辣椒800轉/分），收集沉淀，最終原生質體體積控制在0.5ML左右。
細胞融合：
1. 不同的原生質體各300μl與帶蓋離心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中溫浴15min；
2. 融合液一滴于載玻片上(注意保持一定濕度，不能太干)，輕輕蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。
實驗結果：
用光學顯微鏡或倒置顯微鏡(高倍) 觀察2-3個細胞靠近或融合的過程。（ 觀察時注意不同程度的融合現象。通常分為五個階段。①兩細胞膜接觸，粘連；②細胞膜形成穿孔；③兩細胞的細胞質連通；④通道擴大，兩細胞連成一體；⑤細胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。）