植物原生質體融合的原理及進展

　　摘要

　　本文對植物的原生質體融合技術得研究進展進行了綜述。闡述原生質體制備、培養方面的研究進展，隨后介紹了原生質體融合方法、融合機理和融合方式等的研究進展，最后對其今后的應用前景進行了展望，為原生質體融合技術的發展提供了參考。

　　關鍵詞

　　原生質體 融合技術 研究進展

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　　原生質體制備

　　1.材料的選擇及預處理

　　許多研究表明，在原生質體分離之前，先對植物材料進行預處理能夠有效提高原生質體的游離效率，在同等材料用量下可以分離出較多的原生質體。柳玉晶等[1]的研究表明，在分離百合葉片原生質體前對其進行13%甘露醇預處理和黑暗處理能顯著提高原生質體產量。而在草莓試管苗原生質體分離前，材料預先進行低蔗糖或暗處理均能顯著提高原生質體產量[2]。

　　2.原生質體分離

　　機械分離法是較早采用的一種原生質體分離方法，其操作步驟繁瑣且原生質體產量低，該方法已逐漸被酶解分離法取代。酶解分離法，是目前普遍采用的原生質體分離方法。酶解分離法常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、離析酶等，前3種酶主要是使細胞壁分解釋放原生質體，后一種酶主要作用于細胞間的果膠質，使細胞分離[3]。不同植物原生質體分離所需酶種類、濃度及處理時間均存在差異。張小紅等[4]發現小麥愈傷組織在 2.0%纖維素酶、0.5%果膠酶和0.6 mol/L甘露醇溶液中酶解4~6 h獲得原生質體產量和活力較高。而葡萄葉片原生質體的分離以3.0%纖維素酶和0.75%離析酶的酶組合，在0.6 mol/L甘露醇溶液中，酶解14 h為宜。

　　02

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　　原生質體培養

　　1.培養方法

　　液體淺層培養、固定培養（包括低熔點瓊脂糖包埋和海藻酸鈉包埋）、固液雙層培養、瓊脂糖念珠培養和看護培養是原生質體培養常用的幾種方法[5]。不同植物原生質體培養最適的培養方法不盡相同。李玉珠等[6]研究發現，固液雙層培養較液體淺層培養法更有利于苜蓿原生質體的早期培養和再生。而月季[7]、天竺葵[8]、六出花[9]等原生質體液體培養效果優于固體培養。相關研究發現，與液體培養、固體培養和固液培養相比，看護培養是百合原生質體培養的最佳培養方法[10-11]。

　　2.培養密度

　　原生質體密度是影響生長的一個很重要的因素。密度過低，單位面積上細胞數目少，原生質體間空隙大，原生質體內含物外滲，完整性受破壞，引發褐變，不能繼續分裂或短暫分裂后便衰亡；密度過高，培養空間狹隘，因營養競爭使得再生細胞團較小，正常生長受阻。不同植物原生質體其培養密度不同，一般培養密度為5×102~1.0×106mL-1[12]。蕓薹屬原生質體培養密度一般為0.5×105~1×105mL-1，擬南芥在5×103~1×104 mL-1的低密度下仍可進行持續分裂并能發育成細胞團[13]。

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　　原生質體融合方法及其機理

　　原生質體融合分為自發融合和誘導融合兩種。自發融合是指在分離原生質體期間原生質體經常自發地 合并的現象[14]。在融合誘導化學試劑的作用下不同來源的原生質體融合稱為誘導融合。正常情況下，分離的原生質體彼此并不融合，因為分離的原生質體表面攜帶負電荷（10mV -30mV）圍繞原生質膜的外部。因此，這種類型的融合需要一種融合誘導化學物質或者外力來減少原生質體的負電性，允許原生質體融合[15]。

　　誘導分離的原生質體融合主要有機械融合法、化學融合法和電融合法三種方法。

　　1.機械融合法

　　分離的原生質體在顯微操作儀下產生緊密的物理接觸而融合。

　　2.化學融合法

　　化學融合劑引起分離的原生質體彼此粘附，導致緊密粘著產生融合[16]。化學融合是一種非特異性、費用低的、能夠產生大量融合產物的融合方法，但是這種方法缺點是可能對細胞有毒、非選擇性和融合效率低。

　　2.1 高pH-高濃度鈣離子融合法

　　一般情況下，與鈉離子和鉀離子比較，鈣離子影響細胞融合的效率是很低的[17]，但是在高 pH 環境中高濃度鈣離子會誘發融合效應。

　　2.2 PEG 融合法

　　PEG 是一種大分子（分子量 1000-6000）的水溶性的多聚化合物。一般地使用28-50%PEG 溶液用于細胞融合。因為 PEG 液比病毒更易制備和控制、活性穩定、使用方便、而且促進細胞融合的能力更強，一般使用兩種實驗方法完成原生質體融合。

　　方法一，取大約 0.6ml 的 PEG 融合液(20～45％PEG,moL.wt.1500, 0.1M甘露醇、山梨醇或 蔗 糖 , 8-10 mmol CaCl2, 和0.7mMKH2PO4，pH 5.6)以滴的形式添加到試管中的原生質體中。在蓋好試管后，PEG 中的原生質體在室溫溫育 40min。偶爾旋轉試管使原生質體接觸。在每間隔 10 min 后向試管中添加 0.5-1ml 的原生質體培養基來稀釋 PEG。離心除去融合液，將原生質體沉淀懸浮在培養液中。方法二，取兩種原生質體（密度為 1×105 個/毫升）混合液（比例為 1:1）0.1-0.5ml，靜置 3～5min。首先加入融合液 A （2-8mM CaCl2，0.5-0.7mM KH2PO4 ， 0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇，25%-30%PEG（wt.6000），pH 5.8）0.1-0.5ml，25℃保持15-20min；然后加入融合液 B（2-8mM CaCl2，0.5-0.7mM KH2PO4 ， 0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇，pH 7.0-10.0 ）0.1-0.5ml，25℃保持 10-20min，完成原生質體的融合；再用培養液洗滌（3～4 次），離心（100×g）5min，可以用來觀察和培養，這種 2 步融合法在實驗室中廣泛應用。有學者對 PEG 介導的原生質體融合方法進行了改進，由原來的 2 步融合分為 3 步，逐漸降低 PEG 的濃度，逐步提高溶液中Ca2+的濃度和 pH 值，微量化且省略了離心步驟，操作更簡單[18]。

　　PEG 誘導原生質體融合的機理是，帶有大量負電荷的PEG 與水之間的氫鍵結合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起原生質體凝集，形成大小程度不同的凝集物，鄰近的原生質體之間緊密接觸；PEG 帶有大量的負電荷,能夠結合 Ca2+，與原生質體表面的負電荷連接，形成靜電鍵，促使異源的原生質體間的粘著和結合；此外，PEG 分子具有輕微的負極性，可以與具有正極性基團的水分子、蛋白質、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質體間起到分子橋的作用，使原生質體接觸。在原生質體細胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內蛋白質顆粒易位并凝聚。

　　04

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　　展望

　　目前，通過體細胞雜交技術研究，不僅創造了許多融合方法和融合方式，而且對雜種細胞的篩選以及雜種植株的鑒定和培養進行了大量的工作，取得了很大進展，但是也存在一定的不足。原生質體雜交需要篩選雜種細胞，雜種細胞再生能力差，雜種植株性狀較差(不育、生根能力差、生長勢較弱等)是原生質體融合技術中的主要問題。因此，需要研究誘導融合及雜種細胞的各種生理生化和遺傳機理。開展各種植物的原生質體再生技術研究。探索外源遺傳物質導入原生質體的條件及研究其在原生質體中的表達機制。研究雜種細胞培養和雜種植株的鑒定。將原生質體融合與遺傳轉化、常規雜交等育種方法結合起來, 更有效地轉移優良性狀, 創造優異種質，使這一技術成為研究植物改良和基因相互作用的一種有效的手段。

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