植物基因轉化常用方法3

（三）改良植物性狀的策略
　　基因克隆技術提供了一種新的改良植物的方法，它可以直接的改變植物的基因型。有兩種策略可以應用。
　　1） 基因附加：通過添加1個或多個基因改變植物的性狀。
　　2） 基因扣除：利用基因工程技術使一個或多個植物已經存在的基因失活。
　　滅活植物基因是通過反義技術來實現的。將外源基因反向的連接到載體中，當基因轉錄成mRNA后，與正常的mRNA是反向互補的。我們稱這種反向互補為反義RNA，縮寫為asRNA。
　　反義RNA阻止原有基因表達的機理尚不明了，但可以肯定，正義和反義RNA之間的雜交與這一事件有關，可能雙鏈的RNA很快被核酸酶降解 ，或者反義RNA阻止了核糖體與正義RNA的結合。

                     圖 11-27 反義技術的原理

1 基因附加的方法

我們以抗蟲基因為例來說明。

1.1    理想的殺蟲劑

在農業生產中危害最嚴重的是昆蟲。為了減少損失，一般使用殺蟲劑。大部分殺蟲劑沒有選擇性，殺滅害蟲的同時也消滅了天敵，同時對生物圈中的其他生物產生影響，包括人，污染了環境。有一些生物生長在植物體內，可以避免農藥的傷害。

理想的殺蟲劑具有的特性:

它必須對害蟲有害，但毒性應該有選擇性，對其他生物無害。

殺蟲劑能夠必降解，作物收獲后不存在殘留，并且對環境無污染。

可以保護整個植株，不單單是地上部，免受害蟲危害。

到目前為止，我們還未發現這樣的理想殺蟲劑，最相近的是來自于蘇云金桿菌的δ-內毒素。

a)       蘇云金桿菌的δ-內毒素

蘇云金桿菌在孢子形成的過程中，細胞內形成殺蟲晶體蛋白—稱為δ-內毒素，其活性很強，有時要比有機磷毒性高80000倍，而且選擇性很強，不同品系的細菌和成不同的毒蛋白。

在細菌中積累的δ-內毒素是無活性的前體，昆蟲食用后，前毒素被蛋白酶消化后產生有毒性的蛋白，結合到昆蟲腸道內，破壞表皮細胞，使昆蟲不能進食，從而饑餓而死。不同昆蟲中，晶體結構不同產生了特異性。

蘇云金桿菌并不是最近才發現的，早在1904年即開始使用，可以作為無公害的殺蟲劑，但他很容易降解，所以要不斷的補充，增加了農民的成本。因此研究者試圖生產不需要連續補充的δ-內毒素，一種方法是利用蛋白質工程，修飾其蛋白結構使其更加穩定，另一種方法是通過基因工程是植物能夠合成自己的毒素。

b) 將δ-內毒素克隆到玉米中

傳統殺蟲劑在玉米上效果較差，主要害蟲是玉米螟，生物技術學家試圖獲得能合成δ-內毒素的玉米。

北卡萊羅納Ciba-Geigy實驗室使用Cry1A(b)內毒素，這是一個1155個氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小組并沒有使用完整的基因，只使用了前648個密碼子，人工合成了這一片段，這樣可以對原始基因進行修飾，使用玉米偏愛的密碼子。原始基因中GC含量是38%, 而人工基因的GC含量為65%。

將人工基因連接到盒式載體上，后接一個來自于CaMV的多腺苷酸化信號，利用微粒轟擊法將其引入玉米的胚中。胚胎長成植株后，利用PCR法鑒定。利用人工基因特異的片段作為PCR引物。

下一步工作就是利用免疫技術鑒定轉基因植株是否合成了δ-內毒素，結果顯示人工基因確實具有活性。不同植株中產生的δ-內毒素數量不同，從250-1750ng/mg總蛋白，這種差異是由位置效應引起的。

                      圖11-28  位置效應

轉基因植株是否對玉米螟有抗性呢？在田間條差了6個周，應用兩條標準來衡量：害蟲對植株總的危害，以及蟲道的長度。轉基因植株表現了較好的抗蟲效果，對照蟲道長度1017.5000000000001px, 轉基因植株蟲道只有157.5px。