植物總RNA的分離

實驗概要

認識真核生物RNA的組成及分離的原理；學習RNA提取過程中抑制RNA酶活性的方法。

實驗原理

真核生物的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。一個典型的真核細胞約含有10-5~10-6mg的RNA，其中80-85%為rRNA，其余15-20%主要由各種低分子量RNA組成（如tRNA、核內小分子RNA等），細胞的RNA大多都與蛋白質結合在一起，但這種結合很容易在變性劑存在下打破。在經有機溶劑抽提后，用乙醇或異丙醇可將其從上清中沉淀出來。

RNA提取中要嚴格避免RNA酶的污染，因為RNA酶極穩定，通常的消毒方法難以將其滅活，而空氣中細菌、真菌和操作者都有可能成為RNA酶的污染源。RNA酶污染會使分離的RNA大量降解。

對于rRNA和tRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，當總RNA分離出來后還能用電泳、密度梯度離心、層析等方法加以進一步分離純化。而mRNA的分離將在后續實驗中做到。

主要試劑

1. 異硫氰酸胍

2. CSB（檸檬酸/十二烷基肌氨酸鈉/b-巰基乙醇）緩沖液

3. 2mol/L NaAc pH 4.0

4. 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）

5. 異丙醇

6. 75%乙醇

7. DEPC H₂O等

主要設備

1. 瓷研缽（組織搗碎機）

2. eppendorf離心管

3. 冷凍臺式離心機

4. 液態氮

5. 剪刀

6. 一次性手套

7. 恒溫水浴鍋

8. 真空干燥儀

9. 紫外分光光度計

10. 凝膠電泳裝置

11. 凝膠成像系統等。

進行RNA提出的所有器皿必須保證未受RNA酶的污染，玻璃、瓷器和金屬耐熱器皿應先以0.1%DEPC（二乙基焦碳酸鹽）水溶液浸泡2hr，然后以鋁箔包裹后在180℃烘烤過夜。使用新的塑料制品，并將其在0.1%DEPC中浸泡2hr并經高壓蒸汽消毒30min。操作過程中還應嚴格避免外源RNA酶的污染。

實驗材料

水稻幼苗，剪取幼芽。

實驗步驟

1. 稱取材料0.1g，剪成約2mm長段，加入液氮研磨成細粉狀。

2. 加入0.2g異硫氰酸胍和2ml CSB緩沖液，繼續研磨成勻漿。

3. 將勻漿轉移至兩個eppendorf管中，加入0.12ml NaAc，加蓋后反復顛倒離心管20次。

4. 每管加入1ml酚：氯仿：異戊醇，混勻后劇烈震動10sec，冰浴15min。

5. 10，000g，4℃離心15min。

6. 小心將上層水相轉移至新管中，注意不要吸動中間層。中間層富含蛋白質和DNA。

7. 加入等體積的異丙醇，混勻后置-20℃放置30min以沉淀RNA。

8. 10，000g，4℃離心20min沉淀RNA。

9. 棄上清，將RNA沉淀懸浮到0.5ml CSB溶液中，搖動溶液至RNA溶解。

10. 加入等體積的酚:氯仿:異戊醇重新抽提一次，即重復4—8的步驟。

11. 離心后棄上清，沉淀用0.5ml預冷的75%乙醇漂洗一次。離心后棄上清，真空初步干燥沉淀。

12. RNA溶解在0.2ml  DEPC水中，用紫外分光光度計測定260nm、280nm、及230nm波長的光密度，獲得RNA的濃度和純度。

注意事項

1.   RNA的濃度C=A260×40×測定稀釋倍數（ug/ml），純RNA的A260/A280比值在1.7-2.0之間，若低于該值范圍，表明有蛋白質污染，應重新進行有機溶劑抽提。若高于該范圍，可能有異硫氰酸胍的殘留或有核酸的嚴重降解，應重新進行醇沉淀的步驟。

2. 當前有很多生物技術公司生產分離RNA的試劑盒，如Trizol試劑，將異硫氰酸胍、CSB及苯酚混合在一起，按一定的體積與材料研磨后，即可通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA，可很方便地進行RNA的分離。