植物抗旱性鑒定

水分虧缺是一種最普遍的影響植物生產力的環境脅迫，盡管蔬菜作物一般都在水源充足的地區栽培，但是通常蔬菜需水量大，而且幾乎整個生育期對水分的要求都比較多；而果樹大多栽培于丘陵、土地，更易受到水分虧缺的影響。因此深入研究植物的抗旱性，進行抗旱育種顯得特別重要。

抗旱育種的成敗在很大程度上取決于擁有抗性資源的多少和深入研究的程度，因此，種質資源的抗旱性鑒定、評價與篩選是抗旱育種的關鍵環節，受到世界各國育種工作者的重視。

進行抗旱性鑒定所采用的方法很多，主要包括田間直接鑒定法、干旱棚法、人工氣候室法、盆栽法及室內模擬干旱條件法等。這些方法各有優缺點，適用于不同時期、不同目的抗旱性鑒定與研究。

本實驗將以抗旱性存在差異的普通小麥品種為試材介紹植物抗旱性鑒定的主要方法和步驟。

一、試材及用具

小麥幼苗，發芽箱，濾紙，培養皿，打孔器，天平，干燥器，電導儀，20ml具塞刻度試管，雙面刀片，恒溫水浴鍋，溫度計，玻璃棒，研缽，過濾漏斗，容量瓶（50ml），移液管（2ml、5ml、10ml），高速臺式離心機，分光光度計，微量進樣器，熒光燈（反應試管處光照強度為4000lx）；刻度吸管，G3垂熔玻璃漏斗等。

二、方法步驟

（一）田間直接鑒定

當土壤干旱來臨時，尤其在小麥孕穗至灌漿階段發生旱性時，植株因失水而逐漸萎蔫，葉片變黃并干枯。在午后日照最強、溫度最高的高峰過后根據小麥葉片萎蔫程度分5級記載。級數越小，抗旱性越強。

“1”級 無受害癥狀；

“2”級 小部分葉片萎縮，并失去應有光澤，有較少的葉片卷成針狀；

“3”級 大部分葉片萎縮，并有較多的葉片卷成針狀；

“4”級 葉片卷縮嚴重，顏色顯著深于該品種的正常顏色，下部葉片開始變黃；

“5”級 莖葉明顯萎縮，下部葉片變黃至變枯。

以上是根據凋萎程度定性鑒定品種的抗旱性，也可以把各品種分別種植于旱地（脅迫）和水地（非脅迫），測定旱地小區產量和水地小區產量，以下列公式定量評定品種的抗旱性。

品種的抗旱系數或抗旱指數越大，其抗旱性越強。

（二）發芽試驗鑒定

該方法是在室內人工模擬干旱條件，進行小麥芽期抗旱性鑒定。

1．將供試種子置于0.1%氯化汞溶液中，滅菌消毒10～15min；

2．在直徑10cm培養皿內放4張定性濾紙，加入15%PEG（聚乙二醇）溶液6ml或17.6%蔗糖溶液30ml，每皿1個品種，均勻擺放整齊健康籽粒30粒，重復3～4次；

3．將培養皿放入發芽箱內，25℃發芽7d；

4．分別在萌發后第三天和第七天，測定種子的發芽勢和發芽率，評定品種的抗旱性。也可以同時測定芽鞘長度、根長等，以反映品種的抗旱性強弱。

（三）離體葉片持水力測定

具體測定步驟如下：

1．用萬分之一電子天平稱量小麥旗葉5～10片（或取幼苗展開頂葉若干片，分別稱其鮮重），并對每份樣品進行編號，重復3～4次；

2．將稱過鮮重的葉片放入25℃～30℃的干燥器中，在黑暗條件下干燥2～6h，再稱量失水后葉片的重量；

3．計算每份樣品的失水率：

計算出每一供試品種葉片的平均失水率，并進行比較。一般抗旱性強的品種葉片持水力高于抗旱性差的品種。

（四）游離脯氨酸含量的測定

用磺基水楊酸提取植物體內的脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速、操作簡便，而且不受樣品狀態（干或鮮樣）限制。酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內與其消光度成正比。

2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作為溶劑進行配制，于70℃下加熱溶解，冷卻后置棕色試劑瓶中，4℃下保存備用，兩天內穩定。

1．繪制脯氨酸標準曲線

（1）稱取10mg脯氨酸，蒸餾水溶解后定容至100ml，其濃度為100μg/ml母液。

（2）取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0ml分別放入7個50ml容量瓶中，再分別加入蒸餾水定容至50ml，配成0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/ml的系列溶液。

（3）別取上述各溶液２ml，加入已編號的7個試管中，再分別加入２ml冰醋酸，4ml酸性茚三酮試劑，2ml磺基水楊酸溶液；

（4）搖勻后，用玻璃蓋上試管口，在沸水浴中反應2h；

（5）將試管取出，冷卻至室溫，然后向各試管中加入４ml甲苯，手工充分震蕩后，靜置約10min，紅色反應產物被萃取到甲苯層；

（6）用滴管吸取紅色的甲苯萃取液于比色皿中，在分光光度計520nm波長處測定吸光度；

（7）以脯氨酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2．游離脯氨酸的提取

稱取0.3g葉片鮮樣（來自經干旱處理和對照的不同材料），剪碎后放入具塞試管中，加5ml 3%磺基水楊酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10min，過濾液待測。

3．游離脯氨酸的測定

取提取液2ml于具塞試管中，加入2ml蒸餾水、2ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮試劑，搖勻后在沸水浴中加熱顯色2h，取出后冷卻至室溫，加入4ml甲苯，充分搖勻以卒取紅色產物。靜置約10min，吸取甲苯層，于分光光度計520nm波長處測定吸光度

4．計算樣品中的脯氨酸含量

脯氨酸含量（μg/g）＝（C×V/A）/W

或

脯氨酸含量（%）＝（C×V/A）/W×10-4

式中：C—由標準溶液查得脯氨酸μg數； V—提取液總體積（ml）； A—測定液總體積（ml）；W－樣品重（g）；1g＝106μg。

對許多植物的研究表明，在水分脅迫時，出現游離脯氨酸的大量積累，所以很多研究者主張可將脯氨酸積累的數量作為植物抗旱性的指標。但是，也有些研究表明，各種植物（包括小麥）品種在水分脅迫時，脯氨酸的積累有很大差異，有些抗旱品種在輕度干旱脅迫時脯氨酸含量并不增加，而一些不抗旱品種，器官組織內部水勢下降快，游離脯氨酸積累也快。因此，用脯氨酸積累作為抗旱鑒定指標時，應結合其它抗旱鑒定指標一起評價。

（五）甜菜堿含量的測定

甜菜堿最早在旱生植物寧枸杞中發現，已知有12種，目前研究最多的是甘氨酸甜菜堿（Glycine betaine），簡稱甜菜堿，它廣泛存在于開花植物的各器官。甜菜堿在細胞內的積累可提高細胞的滲透調節能力，穩定細胞內大分子蛋白質與生物膜的結構和功能，還可保護細胞內許多重要代謝活動所需酶類的活性。作為一種非毒性的滲透調節劑，甜菜堿在植物抗逆生理中起著非常重要的作用，研究表明，甜菜堿的積累水平與植物抗脅迫能力成正比。

1．溶液配制

雷氏鹽溶液：精密稱取1.5g雷氏鹽，加水至100ml，用鹽酸調pH值為1，室溫攪拌45min，須在用前配制。

甜菜堿提取液：甲醇：氯仿：水=12：5：3（V/V）。

甜菜堿標準液：精密稱取甜菜堿100mg，用蒸餾水移入100ml容量瓶中，待完全溶解后稀釋至刻度，即得濃度為1mg/ml的標準液。

2．標準曲線繪制

標準曲線的繪制，將標準液按每毫升含0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg配制溶液，吸取以上溶液各3.0ml，水浴放置3h，用G3垂熔玻璃漏斗過濾，3×3ml乙醚洗沉淀，待乙醚揮干，用3×5ml 70%丙酮溶液解沉淀并轉移至25ml容量瓶中，用70%丙酮溶液補充至刻度，用70%丙酮溶液作空白，在525nm處測其吸光度。

3．甜菜堿的提取

稱取1g左右小麥葉片（來自經干旱處理和對照的不同材料），加入10ml甜菜堿提取液，研磨，研磨液于溫水浴中保持10min，冷卻后于20oC離心10m分鐘，收集上層水相，下層氯仿相再加入10ml提取液（甲醇:氯仿:水=12:5:3（V/V））；再離心，取上層水相，下層加入4ml50%甲醇，離心，然后將上層水相合并，調PH5～7，70oC蒸干，再用5ml水溶解。

4．甜菜堿的測定

吸取待測液3.0ml，水浴放置10min，取出，滴加5ml雷氏鹽溶液，冷水浴放置3h，用G3垂熔玻璃漏斗過濾，乙醚洗沉淀，待乙醚揮干，用70%丙銅溶液溶解沉淀并轉移至25ml容量瓶中，用70%丙酮溶液補充至刻度。70%丙酮溶液作空白，在525nm處測其吸光度光度，由標準曲線中查出甜菜堿的含量。

植物體內超氧物歧化酶活性、丙二醛含量及植物組織浸泡的電導率等生理生化指標也可作為抗旱鑒定評價指標，具體測定方法見本教程的實驗40，在此不再詳述。