植物生理實驗使用的材料非常廣泛,根據來源可劃分為天然的植物材料(如植物幼苗、根、莖、葉、花等器官或組織等)和人工培養、選育的植物材料(如雜交種、誘導突變種、植物組織培養突變型細胞、愈傷組織、酵母等)兩大類;按其水分狀況、生理狀態可劃分為新鮮植物材料(如蘋果、梨、桃果肉,蔬菜葉片,綠豆、豌豆芽下胚軸,麥芽、谷芽,鱗莖、花椰菜等)和干材料(小麥面粉,玉米粉,大豆粉,根、莖、葉干粉,干酵母等)兩大類,因實驗目的和條件不同,而加以選擇。
植物材料的采集和處理,是植物生理研究測定中的重要環節。在實際工作中,往往容易把注意力集中在具體的儀器測定上,而對于如何正確地采集和處理樣品卻不夠注意,結果導致了較大的實驗誤差,甚至造成整個測定結果的失敗。因此,必須對樣品的采集、處理與保存給予足夠的重視。
一、植物材料的采集
植物生理研究測定結果的可靠性(或準確性),首先取決于試材對總體的代表性,如果采樣缺乏代表性,那么測定所得數據再精確也沒有意義。所以,樣品的采集除必須遵循田間試驗抽樣技術的一般原則外,還要根據不同測定項目的具體要求,正確采集所需試材。目前,隨著研究技術的不斷發展,應該不斷提高采樣技術的水平。
在作物苗期的許多生理測定項目中都需要采集整株的試材樣品,在作物中后期的一些生理測定項目中,如作物群體物質生產的研究,也需要采集整株的試材樣品,有時雖然是測定植株的部分器官,但為了維持器官的正常生理狀態,也需要進行整株采樣。
除研究作物群體物質生產外,對于作物生理過程的研究來說,許多生理指標測定中的整株采樣,也只是對地上部分的采樣,沒有必要連根采樣,當然對根系的研究測定例外。采樣時間因研究目的而不同,如按生育時期或某一特殊需要的時間進行。除逆境生理研究等特殊需要外,所取植株應是能代表試驗小區正常生育無損傷的健康植株。
為了保證植物材料的代表性,必須運用科學方法采取材料。從大田或實驗地、實驗器皿中采取的植物材料,稱為“原始樣品”,再按原始樣品的種類(如植物的根、莖、葉、花、果實、種子等)分別選出“平均樣品”,然后根據分析的目的、要求和樣品種類的特征,采用適當的方法,從“平均樣品”中選出供分析用的“分析樣品”。
(一)原始樣品的取樣法
1. 隨機取樣
在試驗區(或大田)中選擇有代表性的取樣點,取樣點的數目視田塊的大小而定。選好點后,隨機采取一定數量的樣株,或在每一個取樣點上按規定的面積從中采取樣株。
2. 對角線取樣
在試驗區(或大田)可按對角線選定五個取樣點,然后在每個點上隨機取一定數量的樣株,或在每個取樣點上按規定的面積從中采取樣株。
(二)平均樣品的取樣法
1. 混合取樣法
一般顆粒狀(如種子等)或已碾磨成粉末狀的樣品可以采取混合取樣法進行。具體的做法為:將供采取樣品的材料鋪在木板(或玻璃板、牛皮紙)上成為均勻的一層,按照對角線劃分為四等分。取對角的兩份為進一步取樣的材料,而將其余的對角兩份淘汰。再將已取中的兩份樣品充分混合后重復上述方法取樣。反復操作,每次均淘汰 50 %的樣品,直至所取樣品達到所要求的數量為止。這種取樣的方法叫做“四分法”。
一般禾谷類、豆類及油料作物的種子均可采用這個方法采取平均樣品,但注意樣品中不要混有不成熟的種子及其他混雜物。
2. 按比例取樣法
有些作物、果品等材料,在生長不均等的情況下,應將原始樣品按不同類型的比例選取平均樣品。例如對甘薯、甜菜、馬鈴薯等塊根、塊莖材料選取平均樣品時,應按大、中、小不同類型的樣品的比例取樣,然后再將每一單個樣品縱切剖開,每個切取 1/4 、 1/8 或 1/16 ,混在一起組成平均樣品。
在采取果實的平均樣品時,如桃、梨、蘋果、柑橘等果實,即使是從同一株果樹上取樣,也應考慮到果枝在樹冠上的各個不同方位和部位以及果實體積的大、中、小和成熟度上的差異,按各自相關的比例取樣,再混合成平均樣品。
(三)取樣注意事項
1. 取樣的地點,一般在距田埂或地邊一定距離的株行取樣,或在特定的取樣區內取樣。取樣點的四周不應該有缺株的現象。
2. 取樣后,按分析的目的分成各部分(如根、莖、葉、果等),然后捆齊,并附上標簽,裝入紙袋。有些多汁果實取樣時,應用鋒利的不銹鋼刀剖切,并注意勿使果汁流失。
3. 對于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等樣品,因含水分較多,容易變質或霉爛,可以在冰箱中冷藏,或進行滅菌處理或烘干以供分析之用。
4. 選取平均樣品的數量應當不少于供分析用樣品的兩倍。
5. 為了動態地了解供試驗用的植物在不同生育期的生理狀況,常按植物不同的生育期采取樣品進行分析。取樣方法系在植物的不同生育時期先調查植株的生育狀況并區分為若干類型,計算出各種類型植株所占的百分比,再按此比例采取相應數目的樣株作為平均樣品。
二、分析樣品的處理和保存
1 .從田間采取的植株樣品,或是從植株上采取的器官組織樣品,在正式測定之前的一段時間里,如何正確妥善的保存和處理是很重要的,它也關系到測定結果的準確性。
一般測定中,所取植株樣品應該是生育正常無損傷的健康材料。取下的植株樣品或器官組織樣品,必須放入事先準備好的保濕容器中,以維持試樣的水分狀況和未取下之前基本一致。否則,由于取樣后的失水,特別是在田間取樣帶回室內的過程中,由于強烈失水,使離體材料的許多生理過程發生明顯的變化,用這樣的試材進行測定,就不可能得到正確可靠的結果。為了保持正常的水分狀況,在剪取植株樣品后,應立即插入有水的桶中,對于枝條,還應該立即在水中進行第二次剪切,即將第一次切口上方的一段在水中剪去,以防輸導組織中水柱被拉斷,影響正常的水分運輸。對于器官組織樣品,如葉片或葉組織,在取樣后就應立即放入已鋪有濕紗布帶蓋的瓷盤中,或鋪有濕濾紙的培養皿中。對于干旱研究的有關試材,應盡可能維持其原來的水分狀況。
采回的新鮮樣品(平均樣品)在做分析之前,一般先要經過凈化、殺青、烘干(或風干)等一系列處理。
( 1 ) 凈化 新鮮樣品從田間或試驗地取回時,常沾有泥土等雜質,應用柔軟濕布擦凈,不應用水沖洗。
( 2 )殺青 為了保持樣品化學成分不發生轉變和損耗,應將樣品置于 105 ℃的烘箱中烘 15min 以終止樣品中酶的活動。
( 3 )烘干 樣品經過殺青之后,應立即降低烘箱的溫度,維持在 70 ~ 80 ℃,直到烘至恒重。烘干所需的時間因樣品數量和含水量、烘箱的容積和通風性能而定。在無烘箱的條件下,也可將樣品置蒸籠中以蒸汽殺青,而后于陰涼通風處風干。但在蒸汽殺青過程中,常有可溶性物質的外滲損失,因此,此法僅可作為測量大量樣品干重時的變通方法,在進行成分分析時應盡量避免。烘干時應注意溫度不可過高,否則會把樣品烤焦,特別是含糖較多的樣品,更易在高溫下焦化。為了更精密地分析,避免某些成分的損失(如蛋白質、維生素、糖等),在條件許可的情況下最好采用真空干燥法。
此外,在測定植物材料中酶的活性或某些成分(如維生素 C 、 DNA 、 RNA 等)的含量時,需要用新鮮樣品。取樣時注意保鮮,取樣后應立即進行待測組分提取;也可采用液氮中冷凍保存或冰凍真空干燥法得到干燥的制品。放在 0 ~ 4 ℃冰箱中保存即可。在鮮樣已進行了勻漿,尚未完成提取、純化,不能進行分析測定等特殊情況下,也可加入防腐劑(甲苯、苯甲酸),以液態保存在緩沖液中,置于 0 ~ 4 ℃冰箱即可。但保存時間不宜過長。
2 .已經烘干(或風干)的樣品,可根據樣品的種類、特點進行以下處理:
( 1 ) 種子樣品的處理 一般種子(如禾谷類種子)的平均樣品清除雜質后要進行磨碎,在磨碎樣品前后都應徹底清除磨粉機(或其他碾磨用具)內部的殘留物,以免不同樣品之間的機械混雜,也可將最初磨出的少量樣品棄去,然后正式磨碎,最后使樣品全部無損地通過 1 mm 篩孔的篩子,混合均勻作為分析樣品貯存于具有磨口玻塞的廣口瓶中,貼上標簽,注明樣品的采取地點、試驗處理、采樣日期和采樣人姓名等。長期保存的樣品,貯存瓶上的標簽還需要涂蠟。為防止樣品在貯存期間生蟲,可在瓶中放置一點樟腦或對位二氯甲苯。
對于油料作物種子(如芝麻、亞麻、花生、蓖麻等)需要測定其含油量時,不應當用磨粉機磨碎,否則樣品中所含的油分吸附在磨粉機上將明顯地影響分析的準確性。所以,對于油料種子應將少量樣品放在研缽內研碎或用切片機切成薄片作為分析樣品。
( 2 )莖稈樣品的處理 烘干(或風干)的莖稈樣品,均要進行磨碎,磨莖稈用的電磨與磨種子的磨粉機結構不同,不宜用磨種子的電磨來磨碎莖稈。如果莖稈樣品的含水量偏高而不利于磨碎時,應進一步烘干后再進行磨碎。
( 3 )多汁樣品的處理 柔嫩多汁樣品(如漿果、瓜、菜、塊根、塊莖、球莖等)的成分(如蛋白質、可溶性糖、維生素、色素等)很容易發生代謝變化和損失,因此常用其新鮮樣品直接進行各項測定及分析。一般應將新鮮的平均樣品切成小塊,置于電動搗碎機的玻璃缸內進行搗碎。若樣品含水量不夠(如甜菜、甘薯等)可以根據樣品重加入 0.1 ~ 1 倍的蒸餾水。充分搗碎后的樣品應成漿狀,從中取出混合均勻的樣品進行分析。如果不能及時分析,最好不要急于將其搗碎,以免其中化學成分發生變化而難以準確測定。
有些蔬菜(如含水分不太多的葉菜類、豆類、干菜等)的平均樣品可以經過干燥磨碎,也可以直接用新鮮樣品進行分析。若采用新鮮樣品,可采用上述方法在電動搗碎機內搗碎,也可用研缽(必要時加少許干凈的石英砂)充分研磨成勻漿,再進行分析。
在進行新鮮材料的活性成分(如酶活性)測定時,樣品的勻漿、研磨一定要在冰浴上或低溫室內操作。新鮮樣品采后來不及測定的,可放入液氮中速凍,再放入? 70 ℃冰箱中保存。
供試樣品一般應該在暗處保存,但是,對于供光合、蒸騰、氣孔阻力等的測定樣品,在光下保存更為合理。一般可將這些供試樣品保存在室內光強下,但從測定前的 0.5 ~ 1.0 小時開始,應對這些材料進行測定前的光照預處理,也叫光照前處理。這不僅是為了使氣孔能正常開放,也是為了使一些光合酶類能預先被激活,以便在測定時能獲得正常水平的值,而且還能縮短測定時間。光照前處理的光強,一般應和測定時的光照條件一致。
測定材料在取樣后,一般應在當天測定使用,不應該過夜保存。需要過夜時,也應在較低溫度下保存,但在測定前應使材料溫度恢復到測定條件的溫度。
對于采集的籽粒樣品,在剔除雜質和破損籽粒后,一般可用風干法進行干燥。但有時根據研究的要求,也可立即烘干。對葉片等組織樣品,在取樣后則應立即烘干。為了加速烘干,對于莖稈、果穗等器官組織應事先切成細條或碎塊。