植物染色體制片

實驗概要

掌握染色體制片方法，并自選材料進行染色體制片；學會染色體核型分析。

主要試劑

酒精、冰醋酸、甲醇、鹽酸、鐵礬、蘇木精（或洋紅、石炭酸品紅）、秋水仙堿（或對二氯苯飽和水溶液、8-羥基奎啉、富民隆乳劑）、二甲苯、中性樹膠、石碳酸、甲醛、山梨醇等。

主要設備

顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、吸水紙、紗布塊、解剖針、剪刀、解剖刀、玻璃棒、鉛筆、恒溫水浴鍋、溫度計、冰箱、恒溫干燥箱、顯微攝影系統、照片打印紙。

實驗步驟

1. 壓片法

在生物技術上，除用切片法觀察細胞外，還可用壓片法，尤其是觀察細胞中的染色體數目，用壓片法最為合適，不僅省事，結果也比切片法好。壓片法是將材料置載玻片上，用解剖刀或解剖針撥開，加染液一滴，蓋以蓋玻片，施以壓力，使材料破碎，細胞分散，然后進行觀察。壓片法種類很多，下面介紹兩種：

      (1). 醋酸——洋紅法

此法多用于制備幼小花藥，觀察花粉母細胞減數分裂的壓片。而對根尖壓片有時染色不好(但對洋蔥根尖染色較好)。其步驟如下：

            a. 將花藥或根尖(先切成0.5cm長)，投入卡諾氏固定液中固定1刻鐘至l小時，然后移至70％酒精中保存。

            b. 取固定保存的材料放入鹽酸酒精解離液(95％酒精一份，濃鹽酸一份，將二者混合即成)中5～8分鐘。或置1N鹽酸(取比重1.19的鹽酸82.5毫升，加水至1000毫升即成)中于60℃的水浴溫度下，處理6～8分鐘，至透明為止。

            c. 用清水沖洗干凈解離液。

            d. 取洗凈的材料，放在載玻片上，用醋酸洋紅染液(或醋酸蘇木精染液)染色5～10分鐘。

            e. 然后將材料移至另一清潔的載玻片上。重新用染液裝片，覆以蓋玻片，以鉛筆的橡皮頭端輕輕壓蓋玻片，使材料呈現分散的薄層，置鏡下觀察。

      (2). 鐵礬——蘇木精法

此法一般用于細胞有絲分裂中的染色體計數，由于染色體被染成紫蘭黑色，用于顯微照相，效果較好。（由于各種植物有自己的特殊性，因此，取材的時間、取材的部位、預處理的時間、固定的時問、水解的時間、染色的時間等，都有可能不同。在此只作了大致的介紹，具體材料還需作預備實驗進行摸索。另外還要注意，各次水洗一定要洗干凈沾在材料上的藥液，以免影響下一個步驟的結果。）染色步驟如下(以蠶豆根尖作材料為例)：

            a. 取材：將蠶豆種子萌發。待種子根長至1cm左右，在上午8時～11時之間，切下長約0.5cm的根尖，進行預處理。

            b. 預處理：目的使分裂細胞的染色體縮短和比較分散，便于壓片觀察。預處理是在固定以前進行，方法是將材料切下放入以下溶液：

0.05～0.2％秋水仙堿水溶液中處理2～5小時；

或：對二氯苯飽和水溶液中處理3-5小時；

或：8-羥基奎啉(0.004～0.005％)，處理2～12小時；

或：富民隆乳劑(0.01％)，處理24～48小時；

或：在0～3℃下冷凍處理24小時。

            c. 固定：通常用95％酒精—冰醋酸(3：1)固定液固定1～24小時。固定后換入70％酒精中保存。一般可保存1～2星期，如放入冰箱中(3～8℃)則可保存數月。 (4) 離析：將保存在70％酒精中的根尖，用刀縱切成兩半，換入蒸餾水，然后移入1N鹽酸中，在60℃的水浴中離析10～15分鐘。

            d. 水洗：離析后必須用水洗凈殘留鹽酸，否則會影響染色。

            e. 媒染：將根尖移入4％鐵礬水溶液中，媒染20～30分鐘，然后用水洗凈。

            f. 染色：放入0.5％蘇木精水溶液染色3～5小時，如果需要染色較久(例如過夜)則可將蘇木精溶液濃度稀釋。

            g. 壓片：用鑷子夾取根尖一段，放在載玻片上，滴上一小滴醋酸，迅速搗碎根尖，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭輕壓，使材料分散成一薄層。

            h. 鏡檢：將材料壓好后，放置顯微鏡下觀察。

若要作永久保存，可將玻片放在電冰箱中冷凍，結了冰霜后便可揭下蓋玻片，然后將沾有材料的玻片分別與另外干凈的蓋玻片和載玻片進行封片處理，制作永久玻片。

也可按以下步驟制成永久制片：

            a. 將壓片直接倒放在盛有1/2 45％醋酸  1/2 95％酒精的培養皿中，并使玻片稍成傾斜(一邊可墊上一玻棒)。待過5～10分鐘，即可見蓋玻片從載玻片上脫落下來，此時即按原來位置翻開。

            b. 將已分開的載玻片與蓋玻片，用吸水紙吸去邊去多余的醋酸液，換入冰醋酸 無水酒精(1：1)中，3分鐘。

            c. 將載玻片與蓋玻片移入無水酒精中(二次)，每次3分鐘。

            d. 移入無水酒精 二甲苯(1：1)，3分鐘。

            e. 移入二甲苯(二次)，各3分鐘。

            f. 用加拿大樹膠按原來的位置封藏玻片。

            g. 移入溫箱烘干(20～30℃)，3小時，即得永久制片。

2. 酶法(略)

附：改良石炭酸品紅染色液配制法：取3克堿性品紅，溶于100毫升70％酒精中(可無限期保存)；取10毫升此溶液加入90毫升5％石灰酸水溶液(兩周內用有效)；取此溶液55毫升，加入冰醋酸和37％甲醛各6毫升；取此混合液2～10毫升加入90～98毫升45％醋酸和1.8克山梨醇。這樣便配制成了染色液，此液放置越久后越好使用。

3. 染色體計數與核型分析

首先，計數體細胞染色體數目，統計的細胞數目在30個以上。然后，以體細胞分裂中期的具有高質量的染色體圖像作為形態描述，應以5個以上的細胞為準，測量的內容有：絕對長度=放大的染色體長度÷放大倍數(單位以微米表示)。相對長度=染色體長度÷染色體組總長度×100％，相對長度系數：染色體長度/全組染色體平均長度，染色體長度比：最長染色體長度/最短染色體長度，核型不對稱系數=長臂總長/全組染色體總長，臂比=長臂長度/短臂長度，差值=長臂長度—短臂長度，著絲點指數，等等。另外，還要確定染色體長度類型、著絲點位置，繪制核型分析結果表、核型圖、核型模式圖，攝制模式照片，寫出核型公式，劃分核型類型，等等。最后，根據各項數據、結果進行討論分析。

附：

      (1). 染色體長度類型確定

相對長度系數值長度類型符號記為

≥1.26 長染色體 L

1.25～1.01 中長染色體 M2

1.00～0.76 中短染色體 Ml

≤0.75 短染色體 S

      (2). 著絲點位置確定

臂比值著絲點位置符號記為

1.00 正中部著絲點 M

1.01～1.70 中部著絲點區 m

l.71～3.00 近中部著絲點區 sm

3.01～7.09 近端部著絲點區 st

7.01以上端部著絲點區 t

∞ 端部著絲點 T

      (3). 核型類型確定

      (4). 核型公式表示方法

以芍藥為例： 2n：2x=10=6m 2sm 2st

      (5). 核型模式圖繪制方法

根據核型分析結果表中所列各染色體的相對長度平均值繪制一坐標圖。橫軸上標明各染色體序號，每一染色體與其序號相對應，縱軸表示相對長度值(％)，零點繪在縱軸的中部，并與各染色體的著絲點相對應。此即為該細胞的核型模式圖。