（一）分離前的準備工作
1．工作環境的清潔和消毒
分離培養一般在無菌室、無菌箱或無菌工作臺（超凈工作臺）上進行，無菌室和無菌箱要經過噴霧除塵，并用藥物或紫外線照射消毒（常用消毒藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線燈照射則需20-30分鐘）。在沒有上述設備條件時，在清潔房間里關閉門窗，避免空氣流動，經過噴霧除去空氣及地面灰塵后進行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺上，避免工作時走動，工作人員最好穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。
2．分離用具的消毒
凡是和分離材料接觸的器皿（刀、剪、鑷、針等）都要隨時（至少在使用時）保持無菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次（刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時過長，以防退火）。再次使用時必須重復滅菌。培養皿、試驗等要經過干熱滅菌。培養基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經過高壓蒸氣滅菌。
3．分離材料的選擇
用新發病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點病害應從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。
（二）植物病原菌的分離
1．葉斑類和枝桿病斑類（非維管束侵染）病原菌分離
首先選擇具有典型癥狀的新鮮病葉作為分離材料，按下述步驟操作：
①培養基平板制備：將PDA培養基在微波爐中加熱熔化驗，以無菌操作法將溶化過的培養基傾注入滅過菌的培養基中，每皿經12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（為防止細菌污染，倒碟前給每三角瓶內加6%乳酸4-6滴）。
②病葉或病枝經自來水沖洗，從病斑周轉1-2毫米處的健組織部位剪下（若為枝干，則將帶有病斑的皮層剝下，但）。
③取10毫升小燒杯經酒帶消毒，放入分離材料，倒入0.1%升汞液適量作表面消毒一分鐘，或用1%漂白粉消毒均可。
④消毒后傾出消毒液，用無菌水沖洗2——3，最后一次無菌水不要倒掉。
⑤用滅菌鑷，剪在無菌水中將分離材料剪成2——3毫米大小的方塊，每塊組織均應為病健相間組織。用滅菌鑷子夾取剪好的材料，放入培養基平板上，輕輕按壓。每皿4——5塊，排放均勻。
⑥用蠟筆在培養皿上注明分離代號，日期、姓名，將培養皿翻轉放置于23—25℃
⑦3-4日后挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養基一小塊，轉入試管斜面培養基中央，于25℃溫箱中培養。
2．種子內病菌的分離
將整粒種子或種子的一部分進行沖洗，再經表面消毒（升汞或漂白粉），最后用滅菌水洗滌后移到人工培養基平板上培養（或者直接放在皿內保濕培養于25℃溫箱中）。
3．危害輸導組織病原的分離（以枯萎病為代表）
先將分離莖作表面消毒，然后用滅菌刀剝去表皮，剪取其中小塊變色的維管束組織，再用漂白粉進行表現消毒后，移于培養基平面上培養。
4．分離物的純化
前述方法獲得分離物，必須經過純化，才能成為培養，純化的方法有單孢子分離法和邊續稀釋培養法兩種，后者簡便，為了一般研究所常用。
連續稀釋法：對真菌材料來說，就是從典型菌落邊緣切取含有菌絲的培養基一小塊，移植于另一培養基平板上，待菌落形成后，再依此法移植。如此數次，直至菌落形態典型，無雜菌時即可移入斜面試管中培養保存。 展開 | 