植物真菌病害抗性鑒定

真菌病害是作物產量損失的主要原因之一，作物病害的80%由病原真菌所引起。迄今，對作物真菌病害的控制，一是選育并采用抗性品種，二是使用化學殺菌劑，三是采取預防措施，如輪作、避免受侵染土壤和帶病原植物材料的傳播等。

然而，化學殺菌劑成本較高，且最終導致病原菌的抗藥性，其殘毒還引起環境污染等問題。綜合采用有性雜交及現代生物技術選育并推廣抗病品種，這是所有病害防治策略中最經濟有效的方法。

特別是重組DNA技術的創立和發展，已可將動物、植物、微生物的基因相互轉移，突破了物種之間難以雜交的天然屏障，開辟了植物育種的新途徑。近年來，一些科學家致力于利用基因工程方法，如基因轉移技術，培育抗真菌病害的作物品種。該領域的研究，有的已取得顯著的成果，或出現很好的苗頭，具有誘人的應用前景。

本實驗重點學習小麥條銹病接種和鑒定的方法。小麥條銹病的接種方法很多，有涂抹法、噴粉法、噴霧法、注射法等等。又因接種鑒定的時期不同，分為幼苗鑒定和成株鑒定。

一、試材及用具

小麥盆栽幼苗，菌種，接種針，毛玻璃，小噴霧器、噴粉器，滴瓶，保濕桶，鉛筆，指形管，酒精，塑料薄膜（或玻璃），滑石粉，注射器等。

二、內容說明

抗病性鑒定（evaluation of disease resistance ）是抗病育種的重要基礎，從抗原篩選、后代選擇、直到品種推廣的全過程都離不開抗病性鑒定。狹義的抗病性鑒定是評價寄主品種、品系或種質對特定病害抵抗或感染程度，廣義的抗病性鑒定還應包括病原物的致病性評價。鑒定方法包括自然鑒定、接種鑒定、田間成株鑒定室內苗期鑒定、離體鑒定及間接鑒定等，在實際工作中則需根據植物、病害種類，目的要求和設備條件而定。下面分別介紹如下：

1．田間自然鑒定 自然發病條件下的田間鑒定是鑒定抗病性的最基本方法，尤其是在各種病害的常發區，進行多年、多點的聯合鑒定是一種有效方法。它能對育種材料或品種的抗性進行最全面、嚴格的考驗。田間鑒定的方法因植物種類而異，大田作物的田間鑒定一般要進行人工接種，接種方法又因病菌而異。

對棉花黃萎病等土傳病害，除在重病地設立自然病圃外，在非病地設立人工病圃時，必須用事先培養的菌種，在播種或施肥時一起施入，以誘發病害。對于小麥銹病、玉米大斑病及稻瘟病等氣傳病害，可分別用涂抹、噴霧、及注射等方法進行接種，以使具有抗接觸、抗侵入等抗病機制的品種也得以發病。

病圃的設置與利用是進行抗病性鑒定的基本條件，沒有重而均勻的發病條件就難以對植物品種資源的抗病性做出可靠的鑒定。

按照病圃發生病害種類的不同，病圃可分為單一病圃和多種病害混生病圃。單一病圃的優點是可以避免多種病害的干擾，有利于鑒定不同品種資源對不同病害的抗病性，同時也是選育單抗品種的必要條件；而多種病害混生病圃的優點是可在較短的時間內選育或鑒定具兼抗或多抗性的材料。

對于樹體大、多年生的果樹及觀賞植物進行田間鑒定，可將待鑒定的材料按一定的株行距定植于大田，全年不使用任何殺菌藥，并于發病盛期，每份材料調查100～300個果實或葉片的發病程度，計算病情指數。它的優點是能較全面準確地反應被鑒定材料的抗病性，結果可靠性較強，操作方便。缺點是占用較多的土地，費用較高。賀普超等（1995）、H.Kemp等（1999）及V.Ognjanov等（1999）等分別采用上述方法對葡萄及蘋果的抗病性進行了研究。

2．溫室或田間接種鑒定 這種方法是將病原菌孢子或病毒直接接種到溫室或田間植株的葉片、果實或根上，它適合對所有植物進行抗病性鑒定。由于抗病現象是寄主、病原物及環境條件三者共同作用的結果，因此，這種鑒定結果也能真實地反映被鑒定材料的抗病性，可靠性強。

接種鑒定的技術規程包括育苗、接種體的制備（病菌的分離、保存與孢子誘發）及接種三個環節，接種的方法有點滴法、噴霧法、浸根法、摩擦法及注射法等，葉片及果實接種，適宜選用點滴法或噴霧法，而土傳病菌，如黃瓜枯萎病可采用孢子懸浮液浸根法進行接種。接種材料的發育程度及接種孢子濃度（選擇壓）等因素都會影響鑒定的效果，因此這些因素要通過試驗，以便確立最佳方案。

3．離體接種鑒定 從植物植株上取下子葉、葉片或果實進行離體接種鑒定，可鑒定那些以組織、細胞或分子水平的抗病機制為主的病害，如馬鈴薯晚疫病、小麥白粉病及煙草黑脛病等。離體鑒定具有操作簡便、鑒定結果可靠等優點，可同時分別鑒定同一材料對不同病原菌的抗性，而不影響幼苗正常生長發育和開花結實。

鑒定方法不僅因植物、病菌種類而異，而且抗病性分級標準也因作物、病原菌的種類不同而存在很大的差別，例如白菜霜霉病的病情分級標準是：

病情指數反應了病害的普遍率和嚴重程度，指數越大，說明病情越嚴重，寄主的抗病性越差；指數越小，說明病情越輕，寄主的抗病性越強。

根據病情指數，可將植物對一些病害的抗病性進行分類，其中白菜霜霉病等病害適用下列標準：

免疫（I）：病情指數0

高抗（HR）：病情指數0.01～15.00

抗病（R）：病情指數15.00～35.00

中抗（MR）：病情指數35.00～55.00

感病（S）：病情指數55.00～75.00

高感（HS）：病情指數75.00～100.00

小麥銹病流行地區廣，產量損失大，一般減產25～75%，在某些地區甚至是限制小麥生產的主要因素。選育和栽培抗銹品種是防治小麥銹病危害的最根本有效措施。因此，在小麥育種過程中，必須了解和掌握抗銹性鑒定的方法。

小麥銹病有條銹、葉銹、稈銹三種，由于地區間生態條件的差異，銹病發生的種類不同，而且危害的程度也各異。我國北方冬小麥區以條銹病為主，葉銹病、稈銹病次之；春麥區則以稈銹病為主。銹病的發生受到小麥材料的抗病能力、病原物的致病力和發病環境的影響，因此銹病在自然條件下，并非每年每地均嚴重發生。在進行抗病育種中，除在發病的麥田進行直接鑒定外，有時還必須在人工接種環境下，進行誘發鑒定。

三、方法步驟

（一）銹病病菌接種

1．幼苗接種 一般在溫室內進行，于麥苗第一片葉子長達4～5cm時接種，等充分發病后再進行鑒定，這種方法的好處是可在較短的時間內測定大量材料對銹病的抗病性；便于鑒定不同小麥品種對不同銹病生理小種的抗病性；能防止當地未發現而外地已存在的新的生理小種向外傳播。幼苗鑒定的接種方法有以下幾種：

（1）涂抹法 此法主要用于繁殖少量菌種或接種少量鑒定材料時應用。在接種鑒定前10d左右，將待鑒定的小麥品種的種子，播種于直徑為2.5～3寸左右的小花盆內。每盆播種2～3個品種，其中一個品種為易感病的誘發品種，以用作對照。各品種要相互隔開，插上木簽，注明品種名稱及播種日期等。在開始接種前，先從用以繁殖銹病孢子的麥苗上，采集病菌孢子置放于小指形管中（注明菌種生理小種號及采集日期），然后從指形管中取出少許銹菌孢子放在潔凈的毛玻璃上，用滴管加入少量水，用接種針將銹菌孢子與水拌勻備用。另外用潔凈的手指沾清水或0.1%吐溫（tween）水溶液將麥苗的葉片摩擦數次，去掉葉片表面的蠟質和茸毛，以利于菌液吸附于葉面上。用消毒過的接種針沾上調制好的孢子液，涂抹于麥葉表面進行接種。一般將條、葉銹的孢子接種于葉片的正面，而稈銹病則接種于葉片背面為好。然后記錄并在木簽上注明接種日期及所用菌種。接種后把麥苗隨即放入保濕桶中（即用一鐵皮桶，其內盛水，保持99～100%濕度），再用噴霧器噴降水霧，令麥苗和保濕桶的內壁沾滿霧滴，噴霧不能過量，以防沖掉已接種的銹病孢子。噴霧后，馬上蓋嚴塑料薄膜或玻璃，把保濕桶放置在適當的溫度條件下。經24h左右，再將麥苗取出，移至陽光充分的溫室內，約經二周后麥苗即可發病，此時即可鑒定品種的抗病力。

麥苗接種后，保濕階段要求的最適溫度，條銹為9～13℃，葉銹為15～20℃，稈銹為18～22℃。自保濕桶中取出放入溫室后平均溫度最好分別控制在16～18℃（條銹），18～22℃（葉銹），21～24℃（稈銹）。光照時間每天應不少于12h，冬季光照不足，需每天增加一定時間的人工輔助光照。上述的溫度和光照掌握的好壞是發病充分與否的關鍵。

在分別接種不同生理小種進行鑒定時，接種用的一切用具都要先行消毒，防止可能發生的污染，影響鑒定結果。

（2）噴粉法 小噴粉器經消毒、干燥后，加入適量的干燥滑石粉，再加入少量新采集的銹病孢子，混合均勻待用（滑石粉與孢子的比例約為20～30：1）。接種用的銹病孢子應事先去除混在其中的雜質，以防噴粉時造成噴粉器堵塞。開始接種前，先將已去除葉片蠟質的盆栽麥苗，放入保濕桶內，用噴霧器在麥苗上均勻噴上霧滴，隨即用噴粉器將上述稀釋的孢子粉均勻地噴灑到每盆麥苗的葉片上，再用噴霧器噴霧，使麥苗和保濕桶內壁都沾上水滴，掌握水滴不下滴為度。最后蓋上塑料薄膜，保濕階段和以后各項操作及注意事項同前述。

（3）噴霧法 用小型噴霧器將制備好的新鮮孢子懸浮液（在噴霧器內，加入要接種的銹菌孢子，先用少量清水濕潤后，攪成糊狀，再加入足量的水至淡桔黃色即可）噴在葉片已去蠟質的麥苗上，接種后將麥苗放于保濕桶內保濕，以后的操作及注意事項同前述。
噴粉法及噴霧法適于對大量材料的接種鑒定。

2．成株接種 成株接種多在田間進行，其方法是在待鑒定抗病力的品種或育種材料的四周播種高度感染銹病的品種作為銹病鑒定的誘發行。為了造成發病的環境，以得到可靠的鑒定結果，常需要在誘發行上每隔一定距離的麥苗上進行人工接種，以造成銹病的發病中心。用于接種的銹病孢子應是當地流行的優勢小種，可以是一個小種，也可以是幾個優勢小種孢子混合。接種的方法如下：

（1）噴粉法 接種前，用手沾清水將葉片拂擦數下，以去掉葉片蠟質，然后用噴霧器噴上霧滴，用噴粉器將由滑石粉稀釋好的孢子粉噴于麥苗上，再用噴霧器噴上水霧，隨即用小花盆或塑料薄膜覆蓋保濕，歷時24h揭開。此法多用于麥苗起身前后。

（2）注射法 此法多用于麥苗有一定生長高度的拔節期。接種前，應配制好孢子懸浮液，配制方法同前，于顯微鏡400×視野中平均有10～20個銹菌孢子數為適宜濃度。一般在誘發行上每隔1m左右選取3～5個單莖分別注射接種。其方法是用注射器將孢子懸浮液從小麥心葉與其下的展開葉葉鞘相接處以下約1cm處注射，針頭易向下傾斜刺入，但不要刺穿，擠壓少量懸浮液，以見到心葉處冒出水珠為度。孢子一般懸浮于液面，所以孢子懸浮液必須隨用隨攪拌或震蕩。田間接種注射最好在陰天的傍晚進行。如天氣干旱，接種后在接種點上澆水1～2次，也可以在接種前或接種后適當灌水，以提高田間濕度，利于銹菌孢子萌發、侵染和發病。
除上述二種方法以外，還可以用噴霧法，即將配成的孢子懸浮液噴在誘發行上進行接種。接種后為了有利于銹病孢子萌發、侵染，也要進行保濕。

接種后，約二周后即可發病。但成株的抗病性鑒定一般在小麥乳熟期以后，銹病發展到高峰時進行，每個品種逐個進行調查記載。

（二）抗銹性鑒定

1．幼苗鑒定

衡量小麥品種對銹病的抗病和發病程度，常用到反應型（感染型）、嚴重度和普遍率三個指標。幼苗期鑒定一般考察其反應型。反應型是指植株受病菌侵染后的保衛性反應，可以用過敏性壞死的有無強弱，孢子堆能否形成，孢子堆的大小、多少等來判斷。小麥品種對條銹菌的反應型可分為6級，分級標準如表5－1所示。

2．成株鑒定

（1）反應型：同幼苗鑒定。

（2）嚴重度：即病葉上著生孢子堆部分占整個葉片面積的百分率，用于表示病害發生的嚴重程度。從理論上講，應將小區內的每一葉片都進行統計而后取平均值。但在實際工作中，往往因人力不足，而僅采用目測估計法。總體上目測評定葉片的發病情況，估計出發病的嚴重程度（嚴重率）。目前嚴重率分級標準尚不統一，但多數采用以下7級分級標準：

（3）普遍率：指病害發生的普遍程度，即發病葉片數占調查總葉片數的百分數率。

普遍率＝發病葉片數/調查葉片總數×100%

在實際工作中，一般也采用目測估計法進行觀測。要求較精確鑒定時，可根據被鑒定材料小區面積的大小，隨機選取30～60葉進行觀察記載。