實驗材料 黃化苗
試劑、試劑盒 勻漿緩沖液清洗緩沖液Percoll 梯度溶液
儀器、耗材 分光光度計
實驗步驟
在選好植物材料和勻漿緩沖液后，接下來關鍵的因素包括勻漿方法、緩沖液的 pH、使用的緩沖液與植物組織之間的比例、研磨時間及溫度等（見注釋 5) 。
3.1 勻漿
根據植物組織的不同可以采取不同的勻漿方法，或者幾種勻漿法結合運用。
( 1 ) 直接用預冷的研缽和研槌進行勻漿。
( 2 ) 在燒杯中用 Moulinex 混合器勻漿 20~60s，或者用 Polytron 攪拌器在 50% 的全速下攪拌 5 次，每次 2s。
( 3 ) 在陶瓷攪拌器中高速下攪拌 15s，或低速下攪拌 2 次，每次 15s。
( 4 ) 用商用蔬菜或水果榨汁機將塊莖直接榨汁到 5X 勻漿緩沖液中。
( 5 ) 直接用搓板在勻漿緩沖液中將材料搓碎。
3.2 緩沖液 pH 以及與材料的比例
( 1 ) 使用前勻漿緩沖液的 pH 必須調到 7.8 左右，以確保在細胞破碎后的整個系統 pH 仍能保持在 7.0~7.6。
( 2 ) 對于某些特殊的植物組織，可能需要使用較多的勻漿緩沖液或者勻漿后使用 5 mol/L KOH 或 NaOH 調節以保證最后的 pH 在 7.0 以上。
( 3 ) —般來講，鮮重每克非綠色組織需用 2 ml 勻漿緩沖液，每克綠色組織則需用 4 ml。降低緩沖液的使用量會大大降低線粒體的提取效率。
( 4 ) 在從塊莖組織中提取線粒體時，使用較少的緩沖液也能有較高的提取效率，可能是因為該組織中酸類化合物含量較低的原因。
3.3 過濾及差速離心獲得細胞器粗提物
( 1 ) 勻漿液必須經過 4 層紗布在漏斗上過濾到燒杯或錐形瓶中，殘留在紗布中的勻漿液可以直接擰到濾液中。過濾必須在 4~10°C 條件下進行。
( 2 ) 將濾液轉移到預冷的離心管中（體積依濾液的多少而定，可以是 50 ml、250 ml 甚至 500 ml) ，然后在 1500 g 下用固定轉角的轉頭離心 5 min。轉頭需預冷至 4°C。
( 3 ) 所得沉淀為淀粉粒、核及細胞碎片。將上清液小心轉移至新的離心管中，然后 18000 g 離心 15 min。高速離心所得粽褐色或黃色或綠色沉淀即為含有各種細胞器的粗提物。
( 4 ) 用 5~10 ml 標準清洗液 [ 如 0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES-KOH、pH 7.2 和 0.1% ( m/V ) BSA ] 將細胞器粗提物重新懸浮。如果勻漿緩沖液中所用滲透介質為蔗糖，則 0.3 mol/L 甘露醇應改為 0.3 mol/L 蔗糖。
( 5 ) 將重新懸浮的液體轉移至 50 ml 的離心管中，用清洗液調整體積至 40 ml 后 1000 g 下離心 5 min。
( 6 ) 上清液轉移至新的離心管中，18000 g 離心 15 min。去掉上清液，沉淀用小量體積的清洗液重新懸浮均勻（見注釋 6)。
3.4 密度梯度離心純化線粒體
經上述步驟所得的線粒體可以用來進行呼吸效率的測定。但是根據其組織來源的不同，所得的線粒體常常混有類囊體或淀粉體膜、過氧化物酶體、乙二酸循環體、內質網及細菌，需要經過 Percoll 密度梯度離心進一步純化。
( 1 ) 將清洗過的線粒體溶液注入到 Percoll 梯度的表面，一般從 80 g 黃化植物組織或 40 g 綠色植物組織中提取的線粒體用 35 ml Percoll 梯度溶液，使用 50 ml 的離心管進行離心（見注釋 2) 。
( 2 ) 35000 g 離心 45 min，使用轉角轉頭，降速時不設置「 brake」減速。
( 3 ) 離心后，線粒體呈淺黃色條帶，位于綠色的葉綠體或黃色的質體膜條帶之下 ( 圖 7-2)。用巴斯德吸管將線粒體部分吸出后（避免吸入質體）用 4 倍體積的標準清洗液稀釋，然后 18000 g 離心 15 min。
( 4 ) 所得松軟沉淀可再次用清洗液懸浮，并在同樣速度下離心 15 min。最后所得線粒體沉淀可按 5~20 mg 線粒體蛋白/ml 清洗液（可用 Bradford 或 Lowry 法定量）重新懸浮溶解。