植物組織中蔗糖酶活力的測定

一、目的

了解植物  組織中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力測定的原理。

二、原理

本實驗以Nelson 方法測定酶活力，其原理是：蔗糖酶可將非還原性的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，而葡萄糖作為還原糖含有的自由醛基，在堿性溶液中將Cu 2+ 還原，還原糖本身被氧化成羥酸；砷鉬酸試劑與氧化亞銅生成藍色復合物（砷鉬藍），在510nm 波長下有正比于還原糖濃度的光密度，從而確定蔗糖酶的活力，該法測定的范圍為25~200μg。

三、主要儀器及試劑

1．儀器

（1）分光光度計

（2）刻度具塞試管（20 mL）

（3）恒溫水浴

（4）移液管

2．試劑

（1）4mmol/L 葡萄糖20mL

（2）4mmol/L 蔗糖20mL

（3）0.5 mmol/L 蔗糖200mL

（4）0.2 mol/L 乙酸緩沖液pH 4.5，200mL

（5）Nelson 試劑：

A 試劑：100mL 溶劑中含 Na2CO3 2.5g，NaHCO3 2.0g，Na2SO4 20g，酒石酸鉀鈉 20g。

B 試劑：100 mL 溶劑中CuSO4·5H2O 15g，濃H2SO4 2 滴。

以A:B=50: 2 的比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶質析出。

砷鉬酸試劑：100 mL 中含鉬酸銨5 g，濃H2SO4 4.2 mL，砷酸鈉0.6g。

四、操作步驟

1．標準曲線制作

（1）取9 個具塞試管，按表1 加樣：

（2）向每管中加1mL Nelson 試劑，蓋上塞子，置沸水浴中20 min。冷至室溫，向每管中加1 mL 砷鉬酸試劑。

（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸餾水，混勻。

（4）在510 nm 下測定光密度，以還原糖葡萄糖為橫坐標，以OD510nm 值為縱坐標，制作標準曲線。

2．酶活力測定

取2g 小麥苗，加入2mL 乙酸緩沖液，在冰浴中用研缽研磨成糊狀，12 000r/min 離心10min，留取上清液用于酶活測定。取2 支具塞刻度試管，向每個試管中加入乙酸緩沖液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，適當稀釋的酶液1mL，以同樣處理但不加酶液者為空白對照，室溫下放置10min。

然后向每管中加1mL Nelson 試劑，置沸水浴中20min。冷卻至室溫，向每管中加1mL 砷鉬酸試劑，5min 后，向每管中加7mL 蒸餾水，510 nm 下比色，測定光密度OD510nm。

五、 實驗結果

活力計算：在室溫、pH4.5 條件下，每分鐘水解產生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定義
為酶的1 個活力單位（U）

n：稀釋倍數；

V：酶液的總體積（mL）；

W：樣品重(g)；

t：時間（10min）；

1000：毫摩爾轉化為微摩爾的倍數。