實驗概要
超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于動、植物體內，是一種清除超氧陰離子自由基（O2- ）的酶，它催化下列反應： 
反應產物H2O2可被過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用。因此SOD有保護生物體免受活性氧傷害的能力。已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關系，故成為植物逆境生理學的重要研究對象。
實驗原理
本實驗依據超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。
在有可氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O2- ，O2- 可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙。后者在560nm處有最大吸收，而SOD可清除O2- 從而抑制了甲腙 的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一個酶活性單位定義為將NBT的還原抑制到對照一半（50％）時所需的酶量，據此可以計算出酶活性大小。
主要試劑
1. 0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）； 提取介質50mmol/L pH7.8磷酸緩沖液（內含1％聚乙烯吡咯烷酮）； 2. 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱取1.9399g Met用磷酸緩沖液定容至100ml； 3. 750μmol/L氮藍四唑（NBT）溶液：稱取0.06133g NBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存； 4. 100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml； 5. 20μmol/L核黃素溶液：取0.00753g核黃素定容至1000ml避光保存。
主要設備
高速臺式離心機；分光光度計；微量進樣器；熒光燈（反應試管處光照強度為4000lx）；試管數支；黑色硬紙套。
實驗步驟
1．酶液提取 取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.5～2ml于10000r/min下離心10min，上清液即為SOD粗提液。
2．顯色反應 取5ml指形管（要求透明度好）7支，3支為樣品測定管，3支為對照管，另外1支作為空白，按表1-1加入各溶液。 混勻后將空白管置暗處，其它各管于4000lx日光燈下反應20min（要求各管受光情況一致，反應室的溫度高時時間可適當縮短，溫度低時時間可適當延長）。 表1 各溶液加入量
試 劑（酶） | 用量(ml) | 終濃度（比色時） |
0.05mol/L磷酸緩沖液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黃素 酶 液 蒸餾水 總體積 | 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 |
13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 空白和對照管加緩沖液代替酶液
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3．SOD活性測定與計算 至反應結束后，以不照光的作空白，分別測定其它各管560nm波長下的消光度值，已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性： SOD總活性= ((A0-As)*VT)/(A0*0.5*FW*V1) SOD比活力= SOD總活性/蛋白質濃度
式中 SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位/mg蛋白表示； A0—照光對照管的消光度值； AS—樣品管的消光度值； VT—樣液總體積（ml）； V1—測定時樣品用量（ml）； FW—樣重（g）； 蛋白質濃度單位為每克鮮重含蛋白毫克數(mg/g)。
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