植物細胞懸浮培養

一、目的要求
了解植物  細胞懸浮培養的基本原理，通過實驗掌握植物細胞懸浮培養的方法和技術。并通過實驗練習和鞏固無菌操作技術。
二、基本原理
利用固體瓊脂  培養基對植物的離體組織進行培養的方法在植物遺傳實驗中已經得到廣泛的應用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，比如在培養過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養成分、植物組織產生的代謝物質呈現一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質成分可能對培養物產生影響，從而導致植物組織生長發育過程中代謝的改變而利用液體培養基則可以克服這一缺點，當植物的組織在液體培養基中生長時，我們可以通過薄層震蕩培養或向培養基中通氣用以改善培養基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。
一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉移到液體培養基中進行培養。在培養過程中不斷進行旋轉震蕩，一般可用100～12Or/min 的速度進行。由于液體培養基的旋轉和震蕩，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。在液體培養基中的培養物是混雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團塊，還有接種物的死細胞殘渣。
在液體懸浮培養過程中應注意及時進行細胞繼代培養，因為當培養物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。對于多數懸浮培養物來說，細胞在培養到第18～25d 時達到最大的密度，此時應進行第一次繼代培養。在繼代培養時，應將較大的細胞團塊和接種物殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細胞懸浮培養體系，就包括愈傷組織的誘導、繼代培養、單細胞分離和懸浮培養。目前這項技術已經廣泛應用于細胞的形態、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程  在植物細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經過轉化的植物細胞再經過誘導分化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。
三、器材
超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、磁力攪拌器、恒溫空氣搖床、鑷子、錐形瓶、水稻種子
四、操作步驟
1．配制培養基
(1) 用于誘導水稻愈傷組織的培養基(N6)，見表4－1。
(2) 用于水稻懸浮培養的液體培養基，見表4－2。
按照培養基配方取各種藥品，最后用蒸餾水定容到所需體積。所配制的培養基經高壓蒸汽滅菌后備用，固體瓊脂培養基分裝在250mL 的錐形瓶內，每瓶約分裝30mL。
2．水稻種子的消毒
（1）將種子置于無菌的培養皿內，以體積分數95％的酒精消毒1～2min。
（2）取出后用無菌水沖洗2～3 遍。
（3）將種子放入25.0g/L 的次氯酸鈉溶液中輕輕搖動后，浸泡60min 。
（4）取出后用無菌水沖洗，將次氯酸鈉溶液充分洗凈。
3. 接種
在超凈工作臺內，將滅菌后的水稻種子接到誘導愈傷組織的固體培養基上，每個培養瓶接5～10 粒種子。接種完畢后用封口膜將培養瓶封好，放在26℃的恒溫培養箱中進行黑暗培養。
4．懸浮培養的開始：
當得到愈傷組織后，將其轉人到AA 液體培養基中。注意愈傷組織塊應小于3mm . 若組織塊較大可用無菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養基分裝在250mL 的錐形瓶內．接種完畢后將瓶口用封口膜封好，把培養瓶放到恒溫搖床上進行震蕩培養。調整搖床的旋轉速度，使之為120r/min。培養溫度為26℃，在黑暗中培養。
5．懸浮培養物的保持
進行懸浮培養后要不斷進行觀察，由于培養物的繼代培養與培養瓶內培養物的密度及細胞生長速度有關，因此當發現培養瓶中培養物密度較大時，應及時用無菌的吸管吸取部分培養物到一新的50mL 培養基中繼續培養。同時還要及時淘汰一些大的組織團塊和黃褐色的壞死組織。一般每隔4～7d 就要繼代一次。