一、實驗目的
1. 掌握考馬斯亮藍R250 對植物細胞骨架染色的方法。
2. 通過對洋蔥內皮細胞的處理，掌握植物細胞骨架的制備方法與顯微形態觀察。
二、實驗原理
細胞骨架(cytoskeleton)，是細胞內以蛋白質纖維為主要成分的網絡結構，根據蛋白質纖維的直徑、組成成分和組裝結構的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細胞骨架對于維持細胞的形態結構及細胞運動、物質運輸、能量轉換、信號傳導和細胞分裂等有重要的作用。本試驗采用去垢劑TritonX-100
的緩沖液處理植物材料時，可將細胞的膜結構和大部分蛋白質抽提掉，但細胞骨架系統的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍R250
染色，在光學顯微鏡下可見一種網狀結構。
三、實驗用品
(一)材料 洋蔥
（二）器材 顯微鏡、載玻片、滴管、擦鏡紙、PH 計
（三）試劑
1. 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)
0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液（PB，PH7.3） 50ml
0.15mol/L NaCl
雙蒸餾水加至1000ml
2. PB
0.2mol/L Na2HPO4 77ml
0.2mol/L NaH2PO4 23ml
3. M-緩沖液
咪唑(PH 6.7) 50mmol/L
KCl 50mmol/L
MgC12 0.5mmol/L
EGTA 1mmol/L
EDTA 0.1mmol/L
巰基乙醇 1mmol/L
甘油 4mmol/L
用1mol/L HCl 調pH 至7.2。
4. 1%的Triton X-100/M-緩沖液
5. 0.2%考馬斯亮藍R250 染液
甲醇 46.5ml
冰醋酸 7ml
蒸餾水 46.5ml
6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）
四、實驗操作見圖4-4
取洋蔥內皮1cm 左右
置于含PBS 液的載玻片上
濕潤后，吸去PBS
加2 滴1%Triton X-100/M-緩沖液，5min
吸去緩沖液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min
加PBS 洗2 次，共3min
加0.2%考馬斯亮藍R250 染色30min
用PBS 洗2 次，共2min，吸干
鏡檢并繪圖
圖4-4 細胞骨架標本制作過程