植物花粉母細胞減數分裂制片實驗

實驗方法原理：

減數分裂是生物在性母細胞成熟形成配子過程中發生的一種特殊有絲分裂，它包括連續兩次的細胞分裂，第一次分裂是減數的，第二次是等數的。第一次分裂的前期較長，染色體變化較復雜，可細分為5個時期，即細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期。染色體在減數分裂的行為對遺傳物質的分配和重組產生重大影響。

高等植物在形成雄配子的過程中，花藥內的小孢子母細胞（2n），經過減數分裂最終產生四個小孢子。每個小孢子內的染色體數目已減半為n。以后每個小孢子進一步發育為花粉粒。由于植物花藥取材容易，操作方便，一般作為減數分裂制片材料。在適宜的時期采集植物的花蕾，經固定液殺死固定，使細胞保持活體時形態。然后進行壓片染色等處理，制成減數分裂玻片標本，在顯微鏡下進行觀察，可以看到小孢子母細胞的減數分裂過程（即染色體由雙倍變為單倍體的過程），研究染色體在形態和數量上的動態變化特點。

實驗材料：玉米雄花序   

試劑、試劑盒：

無水乙醇                                                                 

95%乙醇                                                                  

重鉻酸鉀                                                                  

濃鹽酸                                                                  

濃硫酸                                                                 

冰醋酸                                                                  

二甲苯                                                                  

加拿大樹膠                                                                  

洋紅  

儀器、耗材：

顯微鏡                                                                  

解剖針                                                                 

載玻片                                                                  

蓋玻片                                                                  

鑷子                                                                  

培養皿                                                                  

酒精燈                                                                  

吸水紙                                                                 

紗布                                                                  

刀片                                                                 

濾紙                                                                  

火柴

實驗步驟：

1．取材：選取適當大小的花蕾，是觀察花粉母細胞減數分裂的關鍵性步驟。不同植物取材時期不同。

玉米：在抽雄前兩周左右（大喇叭口期），用手指從喇叭口處向下擠捏葉鞘，觸到有松軟感處，即是雄花序所在部位。在該處用刀片縱向劃一切口，用鑷子取出花序分枝。此時雄花序先端小穗穎長4mm左右，花藥長2～3mm，每一分枝中上部小穗發育最早。

取材時間一般在上午9時～10時，不同材料間稍有差異。

2．固定：取下的材料應立即放入固定液中殺死固定。在4～15℃條件下，一般固定時間為24小時。固定后的材料先用95%酒精漂洗至無醋酸氣味，再移到70%酒精中置于冰箱內保存。常用的固定液是法氏固定液，在使用這種固定液時應注意現配現用，固定時不要在陽光下暴曬。

3．染色和壓片：先將已固定的材料置于培養皿內并倒入少許保存液。用鑷子摘取一個適當大小的小穗或花蕾放在吸水紙上吸掉多余的酒精，然后放在載玻片中央。用解剖針挑出2～3個花藥，并立即滴醋酸洋紅或醋酸鐵礬蘇木精染色液于花藥上。用解剖針將花藥橫向切斷，并從一端向切口輕輕擠壓花藥，使花粉母細胞從切口處逸出。然后用鑷子除盡花藥壁等雜物。這是壓片優劣的關鍵步驟之一，如不去凈殘渣，則不容易把分裂的細胞壓平，使染色體不容易分散開，并且在制作永久片的過程中，細胞會從載玻片上大量脫落。去凈殘渣后，在低倍鏡下進行初步鏡檢，如果花粉母細胞處于減數分裂時期，即可加上蓋玻片。加蓋玻片時，先使蓋玻片的一邊放在載玻片上，待染液布滿整個邊緣時，左手握鑷子頂住蓋玻片，右手握解剖針托住蓋玻片輕輕放下。加上蓋玻片以后，如有多余染色液，可用吸水紙吸去；如染色液不能布滿蓋玻片，則在蓋玻片一邊稍加染色液，然后在酒精燈上烤片。烤片時，用手平持片子在酒精燈上方來回移動，并經常將片子放在手背上試溫，以片子不燙手為宜，可反復進行多次。烤片是制片過程中的一項很重要的步驟。通過烤片可使細胞質顏色變淺，而染色體能得到充分鮮明的著色。烤片以后可在蓋玻片上加一小塊吸水紙，以拇指或用帶橡皮頭的鉛筆輕壓蓋片。應注意不要使蓋片移動。如果鏡檢發現染色體染色太淺，可在蓋玻片周圍稍加染色液再烤；如果染色太深，可從蓋玻片一邊滴加45%冰醋酸，在另一邊用吸水紙吸，讓冰醋酸從蓋玻片下流過直至細胞質顏色較淺而染色體著色明顯清析為止。

4．制作永久片：要使片子能長期保存應用，可制成永久片。永久片的制作主要包括分片，脫水透時和封片三個步驟。首先用培養皿（內置U型玻璃管或一根短玻棒）若干套編號，配制多級脫水劑（常用脫水劑見附錄二）。

（1）分片：準備制成永久片，首先使其翻轉讓蓋玻片朝下浸入第一級培養皿內分片。讓載玻片的一端搭在短玻棒上，另一端和皿底接觸，使蓋玻片自然脫落，并標記載玻片和蓋玻片原來相對應的方向和位置。

（2）脫水透明：用一端劈開的去磷頭火柴棒夾住蓋玻片（方向不變，材料朝上），放入第二級培養皿中。而載玻片要翻轉使有材料的一面朝上。然后依次逐級脫水，一般每級約1～2分鐘。如用第三種脫水劑每級約20～30秒鐘。為了防止在脫水過程中細胞從片上脫落，在制片時可先在蓋玻片上涂一層蛋白甘油膠，在酒精燈上烘烤至冒出輕煙后，稍涼片刻蓋在有材料的載玻片上。

（3）封片：片子從最后一級培養皿內取出后稍涼，于載玻片上原來加蓋玻片的位置中間滴一滴完整的加拿大樹膠，然后翻轉蓋玻片（使有材料的一面朝下），按原來的方向和位置輕輕蓋在樹膠上。要使蓋玻片隨著膠的擴展自然下沉，不要施加壓力或移動蓋玻片。然后平放在陰涼處晾干再鏡檢。對于鏡檢符合要求的片子，在載玻片右端貼上標簽，注明標本名稱，制片日期。

[附]冷凍分片法：這種方法快速簡單。對準備制作永久片的玻片，先用液態二氧化碳干冰冷凍，或用冰凍致冷器進行冷凍，待完全冷凍結冰后，用刀片將蓋玻片同載玻片分開，將載玻片和蓋玻片放在37℃左右的溫箱內烘干。取出后放在二甲苯內浸泡10～20分鐘，滴加樹膠封片即可。